31表达下调抑制TNF-α刺激的NF-κB通路的激活RNF31.PDFVIP

J South Med Univ, 2014, 34(12): 1713-1720 doi 10.3969/j.issn. 1673-4254.2014.12.02 ·1713 · 基础研究 RNFRNF3131 表达下调抑制表达下调抑制TNF-TNF-αα刺激的刺激的NF-NF-κκBB 通路的激活通路的激活 1 2 2 2 2 陈 洁 ，陈 慧 ，詹轶群 ，杨晓明 ，于 淼 1 2 天津大学制药工程专业，天津 300072 ；军事医学科学院放射与辐射医学研究所，北京 100850 摘要：目的 利用慢病毒干涉下调内源性RNF31 表达，研究NF-κB 通路的活化及对细胞凋亡的影响。方法 将人RNF31 的 shRNA 片段克隆到慢病毒表达载体pGreenPuro 中，瞬时转染HEK293T 细胞，筛选出有效的干涉片段。将重组表达质粒与包装 质粒PMD、SPA 共转染293T 细胞，在24 h、48 h 分2 次收集慢病毒上清，用流式细胞术检测病毒滴度。将获得的病毒感染 HEK293 细胞，提取细胞蛋白，Real-time PCR 以及Western Blot 检测RNF31 干涉效果；报告基因实验检测敲低RNF31对NF-κB 转录活性的影响；Real-time PCR 检测干涉RNF31 对TNF-α诱导的NF-κB 下游靶基因的影响；Western Blot 检测下调RNF31 对 IκBα活化的影响；Hochest 染色检测下调RNF31 对细胞凋亡的影响。结果 成功构建RNF31 干涉慢病毒pGreenPuro-RNF31 载 7 pfu/ml 。在HEK293 细胞中下调RNF31 ，抑制TNF-α刺激的NF-κB 的转录活性，并抑 体并获得慢病毒颗粒，病毒滴度可达3×10 制NF-κB 下游靶基因的表达；下调RNF31 抑制TNF-α刺激的IκBα的活化；此外，在TNF-α刺激细胞24 h 时，RNF31 表达下调使 细胞凋亡增多。结论 RNF31表达下调抑制TNF-α刺激的NF-κB 通路的激活。 关键词：E3泛素连接酶RNF31 ；慢病毒；NF-κB ；转录调节 Lentivirus-mediated interference of E3 ubiquitin ligase RNF31 inhibits tumor-necrosis factor-α-induced activation of nuclear factor-κB pathway 1 2 2 2 2 CHEN Jie , CHEN Hui , ZHAN Yiqun , YANG Xiaoming , YU Miao 1Department of Pharmaceutical Engineering, Tianjin University, Tianjin 300072, China; 2Institute of Radiation Medicine, Academy of Military Medical Sciences, Beijing 100850, China Abstract: Objective To study the effect of E3 ubiquitin ligase RNF31 knockdown on nuclear factor-κB (NF-κB) pathway activation and cell apoptosis. Methods Human RNF31 siRNA sequences were cloned into the lentiviral vector pGreenPuro and transiently transfected in HEK293T cells to screen the most effective fragments, which were co-transfected along with