染色体G显带操作规程.docVIP

染色体G显带操作规程1.目的：2.应用范围：3.职责：4.内容： 4.1实验原理：4.1.2.2．秋水仙素（colchicum）是一种生物碱，因最初从百合科植物秋水仙（Colchicum autumnale）中取出来，故名。分子式C22H25O6N，纯秋水仙素呈黄色针状结晶，熔点157℃，易溶于水、乙醇和氯仿，难溶于热水、乙醚等。味苦，有毒。秋水仙素能抑制有丝分裂，破坏纺锤体，使染色体停滞在分裂中期。这种由秋水仙素引起的不正常分裂，称为秋水仙素有丝分裂（C-mitosis）。在这样的有丝分裂中，染色体虽然纵裂，但细胞不分裂，不能形成两个子细胞，因而染色体加倍。秋水仙素是一种三环结构化合物，第2和第3个环均是7元环。它是甲基醚的类似物，包含4个甲氧基，1个乙酰化的初级氨基以及3个非苯型双键。秋水仙素分子的第一个环上由三个甲氧基，这是作用活性不可缺少的反应基团；第二个环内的氨基被酯化，从而可增加其活性；第三个环的水合基团被甲基取代。正因为如此，秋水仙素不仅易溶于水，而且即便所用的浓度极低，其反应活性仍很高。 4.1.3．低渗 4.1.3.1．细胞经过秋水仙素处理后，尽管染色体已经比较适合观察了，但仍还不能满足要求，因为人类细胞的染色体数目多，形状小，最大的染色体约为7～8微米，加之主要的观察与分析均在油镜下进行，这就要求标本中的染色体彼此散开，并且尽可能处于同一平面上，这些均有赖于低渗处理。覆盖在染色体上的核仁物质大大地阻碍着染色体的分散，低渗液的渗透作用不仅可使粘附于染色体的核仁物质散开，清楚地显示每一个扭曲的染色体，而且还可以使细胞膨胀，染色体铺展。 4.1.3.2．低渗溶液是指渗透压和离子强度均低的溶液。可以是水，低渗的柠檬酸钠或氯化钠、甘油磷酸钾（0.65mol／L）、氯化钾（0.075mol／L）、稀释的平衡盐溶液或培养基。处理的时间一般为20～40min，处理时的温度为23～37℃。早期研究中多用柠檬酸钠或柠檬酸钾作为低渗液，也有些学者使用稀释的人血清。自从1965年后，人们改用0.075mol／L的KCl作为低渗液，它可以使染色体的轮廓清楚，可染色性增强，染色时间缩短。在相差显微镜下观察，KCl低渗处理标本的效果比其他低渗液更好，也适用于显微分光光度分析，当用显带染色时充分显示带型的特点。 4.1.4．固定 4.1.4.1．固定是将组织细胞或其成分选择性地固定于某一特定阶段的过程，其目的是在杀死细胞的同时避免所研究成分受到破坏。就细胞遗传学研究而言，固定的目的是在于提高染色体结构的可见性和显示染色体形态的细节，例如显示常染色质区和异染色质区，初级缢痕和次级缢痕等。 4.1.4.1.1．经秋水仙素处理后的细胞虽可用各种不同的固定液（金属固定液或非金属固定液）予以固定，但一定要在固定之前把秋水仙素从组织细胞上冲洗掉，否则，沉积在细胞表面的秋水仙素会影响染色体的形态，还会阻碍固定液穿透性。为此，在低渗处理后，应尽早加入固定液进行预固定。固定剂可迅速地穿透细胞，并将细胞瞬间杀死，使正在分裂的细胞立即阻留在各自特定的细胞周期时相上，否则原有的M期细胞的核分裂会继续下去，染色体松解为染色质，导致研究无法进行。另外，预固定可使细胞都处于相同的固定微环境中，这样固定收获的细胞不会凝结在一起。 4.1.4.1.2．为使染色体结构不受破坏，提高染色体的可见性及染色体的嗜碱性，就需要是染色质物质沉淀。在活体条件下，细胞内不同成分的折射系数之间相差较小，在显微镜下不能分辨出明显的染色体结构；随着核蛋白的凝结和沉淀，染色体的折射系数将会发生很大的变化，从而使它们在细胞内成为明显的小体。因此迄今所用的固定剂都具有交联蛋白的特性，都能使染色质沉淀。常用的染色体固定剂往往是数种化学物的混合物，其中至少有一种化学物必须具备这一特性。 4.1.4.1.3．随着细胞的死亡而出现的另一些变化（特别是蛋白质的自溶作用），往往会破坏染色体的原来结构。在正常情况下，细胞内的酶参与蛋白质的合成，而当细胞死亡时，由于介质变为酸性，这些酶便在相反方向起作用，即使是复合蛋白质裂解为简单的氨基酸也是如此。因为多肽是染色体的主要成分之一，所以，这种变性效应最终引起染色体结构的破坏。因此，作为一种固定剂也应能防止蛋白质的自溶作用。此外，在细胞致死的同时，细菌的活动猖獗致使细胞内成分的分解。因此一种好的固定剂当既能起到防腐作用，又能阻止这种分解作用。 4.1.4.1.4．理想的固定剂还应能有助于达到优良的染色效果，即能增强染色体的嗜碱性。显而易见，没有哪一种化学物能同时具备以上这些条件，因而通常是将数种可以共存的液体混合起来，使之成为染色体研究中真正有效的固定剂。尽管如此，哪怕是最佳的固定剂，仍难免有不足之处。首先细胞被杀死后发生的一些变化很难予以避免；其次，可能会抽提出