第13章DNA芯片技术.docVIP

第十三章 DNA芯片技术 DNA芯片技术是在分子生物学与微电子学基础上发展起来的一种高新技术，具有重要的理论意义和广泛的应用前景。 本章重点讨论：DNA chips技术的基本概念；基本原理与方法及其应用。 第一节 概述 DNA chips技术的基本概念 DNA chips技术：是指在固相支持物上原位合成寡核苷酸或直接将大量DNA probe以显微打印的方式有序地固定在支持物表面上，然后与标记的样品进行杂交，通过对杂交信号进行检测分析，即可得出样品的遗传信息（基因序列及表达信息）。 DNA chips=gene chips=DNA array DNA chips：检测Nc与Pr Biochips protein chips：检测Pr 其它芯片 样品制备芯片 核酸扩增芯片 毛细管电泳芯片 广义Biochips: 还包括缩微芯片实验室（laboratory on a chip, microlab）。 DNA chips的主要类型 按其制备的方式不同分为两类 1．原位合成芯片（synthetic gene chip）：应用显微光蚀刻（photolithograpy）技术，在芯片的特定部位合成寡核苷酸而制成的芯片。 优点： 集成度高，10—40万点阵/ cm2。 缺点： Probe长度较短，50Nt。 2．DNA微集阵列（DNA microarray）：将预先制备的DNA Probe，以显微打印的方式有序的固定在固相支持物的表面上而制成的。又称DNA微集芯片（microchips）。 优点：探针组来源灵活，合成的Probe长，可达500Nt。 缺点：集成度较低，1—10万点阵/cm2。 第二节 DNA芯片技术的基本原理与方法 主要包括四个方面： 芯片的制备 实性材料 （一） 支持物 膜性材料：聚丙烯膜，尼龙膜，硝酸纤维素膜 实性材料表面要引入活性基因（如—OH，—NH2），并用光敏保护基团进行保护，引入的基团能与活化的Nt或者DNA中的基团形成共价键，结合于支持物的表面。膜性材料要包被氨基硅烷或polylys（多聚赖氨酸），使其带上正电荷以吸附带负电荷的DNA Probe。 （二）原位合成芯片的制备 制备技术有两种： 1．显微光蚀刻（photolithography）技术 合成时，不需要聚合的部位用光刻掩膜进行保护，需要聚合的部位由于无掩膜，经激光点光源照射后，光敏保护基团被去除，其活性基团就可以与加入的经亚磷酰胺活化的Nt发生共价偶联，该Nt的另一端用光敏保护基团X保护，以便下一个Nt的延伸：然后更换掩膜，使支持物上的其它部位分别去保护，依次偶联上其它的Nt，完成第一循环，共4步反应（每加一个Nt为一步反应）。 图： 光刻掩膜（mask） X X X X 光敏保护基团 X X X T—X X X X X 去保护基团 T X X X X 掩膜保护 T 重复 X X X X T G C A ，完成了第一循环；然后按上述步骤依次进行反应， 逐个接上不同的Nt，直至合成所需长度的寡核苷酸。 优点：合成速度快，步骤少，Probe数目量n次方增加。例如：八聚核苷酸，经4×8=32步反应，不到8h，可合成48=65536个不同序列的Probe。 缺点：产率低，每步反应产率为95%，合成30Nt的寡核苷酸，产率仅为20%，合成的Probe较短。若去保护不彻底，会使杂交信号模糊，信噪比低。 2．压电打印（piezoelectric printing）技术 是喷墨打印技术的一种，其核 心组件是一个压电毛细管喷射器；其上端装有储液囊，中端有一个压电感 应元件，通过压电感应装置的舒缩，控制液滴的喷射与否。 图： 如此完成第一个循环，然后固定、洗脱、去保护；再继续进行寡核苷酸延 伸的下一个循环，直至合成所需长度的寡核苷酸。 优点：合成的Probe长，可达40—50Nt；产率高，30Nt可达74%。 （三）DNA微集阵列的制备 先制备Probe，然后再打印在芯片上。 1．Probe的制备 1）已克隆的基因片段；2