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本科学生综合性实验报告 ? 姓名 陈春梅 学号 134120072 学院 生命科学学院 专业、班级 生物科学13级B班 实验课程名称 植物生理学 教师及职称 李忠光 开课学期 2015 至 2015 学年 第二 学期 云南师范大学教务处编印 实 验 室 睿智三栋 实 验 时 间 周三下午7-8节 实 验 名 称 光合色素的提取、理化性质 分离、吸收光谱及含量的测定 光合色素含量的测定 1、实验目的 1、掌握光合色素的提取方法以及了解有关的理化性质。 2、掌握光合色素的分离方法以及了解有关的吸收光谱。 3、掌握用分光光度计测定叶绿素含量的方法。 2、实验仪器及试剂 材料：小桐子叶片、植物叶片 3、实验原理 （1）、光合色素能溶于具有一定极性的有机溶剂，如丙酮、乙醇等。 提取液中无任何电子受体，因此可以观察荧光现象。 离体叶绿素在有氧气和光照条件下，发生光氧化作用，结构遭到破坏，形成加氧叶绿素等产物。 叶绿素是一种双羧酸酯，可以发生皂化反应。 叶绿素分子中Mg2+与仆啉环结合不稳定，可以被H+、Cu2+、Zn2+等离子所取代。 （2）、光合色素能溶于具有一定极性的有机溶剂，如丙酮、乙醇等。 不同光合色素的分子量、分子结构、极性、溶解度、支持物对它们的吸附力等不同，因而分配系数不同，故彼此可以分开。 叶绿素的卟啉环结构对光有很强的吸收，主要是红光和蓝紫光。 （3）、混合液中的两个或多各组分，只要它们的光谱吸收峰不互相重叠，仍然可以根据Lambert-Beer定律（A = k L C）求出各组分含量。Lambert定律：A = k L；Beer定律A = k C。叶绿素a、b在80%丙酮溶液中的Amax分别为663nm、645nm，由此得出：见推导过程 Ca = 12.7 A663 – 2.69 A645；Cb = 22.9 A645 – 4.68 A663 Ca+b = 8.02 A663 + 20.20 A645 A663 = Ca.ka1 + Cb.kb1 A645 = Cb.kb2 + Ca.ka2 分光光度计测出，故求二元一次方程组可得到此公式。 k——比吸收系数。即溶剂和波长不变的情况下，当物质的浓度(C)为1g/L(0.1%)，比色皿的直径(光径，L)为1cm时所测出的吸光度即为比吸收系数。故其单位为： ε——摩尔吸收系数。即溶剂和波长不变的情况下，当物质的浓度(C)为1mol/L，比色皿的直径(光径，L)为1cm时所测出的吸光度即为摩尔吸收系数。故其单位为： 4、实验方法、步骤及现象 （1）、光合色素的提取：将植物叶片洗净并用滤纸洗干，取1/2片叶片，放入研钵中并加入少许CaCO3和石英砂及5 ml丙酮，充分研磨，再加入10 ml丙酮，研磨，静止片刻，上清液过滤于三角瓶中，待用。 方法及步骤 光合色素的提取：将植物叶片洗净并用滤纸洗干，取1/2片叶片，放入研钵中并加入少许CaCO3和石英砂及5 ml丙酮，充分研磨，再加入10 ml丙酮，研磨，静止片刻，上清液过滤于三角瓶中，待用。 观察荧光现象：与光线垂直的方向观察色素颜色。 光破坏作用：1ml色素提取液于室内，1ml于太阳光下，30min后观察颜色变化。 皂化反应：取一支试管，加入色素提取液2.5ml，再加入20%KOH甲醇溶液1ml，摇匀，再加入苯2.5ml，轻轻摇动，沿试管壁慢慢加入自来水1ml，轻轻摇动后观察，注意观察整个过程颜色的变化。 取代反应：取一支试管，加入3ml色素，逐滴加入50%醋酸直至溶液变为黄褐色。倒出一半，加入少许醋酸铜粉末，酒精灯上加热，与另一半比较颜色的差异。 （2）、光合色素的提取：将植物叶片洗净并用滤纸洗干，取1/3片叶片，放入研钵中并加入少许CaCO3和石英砂及5 ml丙酮，充分研磨，再加入10 ml丙酮，研磨，静止片刻，上清液过滤于三角瓶中，待用。 光合色素分离： 剪取适当长度和宽度的滤纸条→ 用上行纸层析法分离色素→ 启动剂：石油醚：丙酮：苯=10：2：1。 吸收光谱的测定： 光合色素的吸收光谱：取色素溶液1 mL，加入丙酮3 mL，摇匀后在分光光度计上400到700 nm处每隔10 nm进行扫描。 各色素的吸收光谱：上述层析出的3~4种色素，分别剪下后溶于3 mL丙酮中，按上述方法扫描。 （3）、方法一：快速测定法 由于叶绿素a、b在652nm处有共同吸收，k = 34.5 L g-1. cm