固氮粪产碱菌ntrc基因部分缺失突变株的构建及其特性-oalib.pdfVIP

简 报 第45 卷 第4 期 2000 年2 月 固氮粪产碱菌ntrC 基因部分缺失突变株的 构建及其特性 程红梅 林 敏 平淑珍 贾士荣 ( 中国农业科学院原子能利用研究所, 北京100094; 中国农业科学院生物技术研究所, 北京 100081. Email: Chenghm@public2 .east.cn.net) 摘要 为研究粪产碱菌ntrC 基因表达产物对其他固氮基因表达的调节功能, 构建了 ntrC 基因的 部分缺失突变株. 将粪产碱菌 A1501 ntrC 基因克隆于自杀性质粒 pSUP202 上, 获得重组质粒 pSUM1, 将lacZ-Km, Km 基因片段替换重组质粒中的ntrC 片段, 获得ntrC 部分缺失的自杀性质 粒pSUM2, pSUM3. 采用同源重组双交换法将上述两质粒与野生型A1501 中的ntrC 同源片段置 换, 获得ntrC 部分缺失突变株. 对ntrC 突变株研究结果表明: (1) ntrC 突变株保持一定固氮活性, 但仅是野生型的20%. (2) ntrC 突变株在以硝酸盐为唯一氮源时不能正常生长. (3) ntrC 的表达不 需要自身产物的调节. (4) 粪产碱菌中nifH 的表达受ntrC 正调节, ntrC 缺失突变导致其活性下降, 甚至失活. (5) ntrC 突变对粪产碱菌中nifA 的表达影响不大. 关键词 粪产碱菌 ntrC - 突变株 nif 基因表达调控 生物固氮 ntrC 基因参与生物固氮的一般氮代谢系统和固氮系统的氮代谢和氮固定过程, 是具有重 要功能的正调节基因, 其产物 NtrC 是一种增强子结合蛋白, 在氨控制下能激活s 54 聚合酶的 [1] 转录 . 联合固氮菌既不同于共生固氮菌, 也不同于自生固氮菌, 在分子和基因水平上有其自 身的调控机制, 这方面研究得最多的是肺炎克氏杆菌 (Klebsiella pneumoniae , 以下简称 Kp) 和巴西固氮螺菌 (Azorhizobium brasilense ). 已证明Kp 菌中磷酸化的NtrC 可激活 nifA, 导致 整个固氮系统的活化, 在A.brasilense 中NtrB 和NtrC 可控制固氮酶的活性, 但并不是固氮基 [2] 因表达所必须的 . 粪产碱菌作为一种高效的联合固氮菌株, 在分子和基因水平同样有其自身的调控机制, 本实验室曾将Kp 菌的ntrC 导入粪产碱菌中, 获得具有高效耐铵能力的工程菌株A1523[3], 并 构建了粪产碱菌 ntrC-lacZ 融合基因, 研究了 ntrC 在自生和与水稻根联合固氮条件下的表达, [4] ntrC 在粪产碱菌固氮系统表达调控中可能起着关键的正调节作用 . 本工作在构建 ntrC 部分 缺失突变株的基础上, 研究 ntrC 缺失对其他固氮基因 nifA 和 nifH 的调节作用, 并探讨了粪 产碱菌固氮基因表达的调控机制. 1 材料与方法 本实验所采用的菌种和质粒列于表 1. 质粒 DNA 提取, 限制性内切酶酶切, DNA 片段回 [6] 收, D