利用原核表达系统一步法制备生物素标记蛋白质.pdfVIP

中国生物工程杂志　ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１４，３４（１）：３６４１ ＤＯＩ：１０．１３５２３／ｊ．ｃｂ 檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪殏 檪 殏 檪 檪 技术与方法 殏檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪殏 利用原核表达系统一步法制备生物素标记蛋白质 １ １ １ １ １ １，２ 谢小丽 　程剑松 　王晓敏 　梅香寒 　刘　琳 　李　静 （１南开大学药学院天津市分子药物研究重点实验室　天津　３０００７１　２天津化学化工协同创新中心　天津　３０００７１） 摘要　传统的蛋白质生物素标记多采用体外化学修饰法，涉及生物素和蛋白质的活化、透析和纯 化等多种处理，该方法步骤繁琐，且对目的蛋白的损失较大。本实验利用原核共表达质粒 ｐＣＤＦＤｕｅｔ１，将含有６个组氨酸标签的人己糖苷酶Ｄ（ｈｅｘｏｓａｍｉｎｉｄａｓｅＤ，ＨｅｘＤ）的ｃＤＮＡ与生物素 受体多肽（ｂｉｏｔｉｎａｃｃｅｐｔｏｒｐｅｐｔｉｄｅ，ＢＡＰ）ＤＮＡ进行 ＰＣＲ拼接，连入 ｐＣＤＦＤｕｅｔ１的多克隆位点１ （ｍｕｌｔｉｐｌｅｃｌｏｎｉｎｇｓｉｔｅ１，ＭＣＳ１）；将以大肠杆菌 Ｔｒａｎｓ５ 基因组为模板克隆得到的生物素连接酶 α （ｂｉｏｔｉｎｌｉｇａｓｅ，ＢｉｒＡ）基因连入ＭＣＳ２，构建重组质粒ｐＣＤＦＤｕｅｔｈｅｘＤＢＡＰｂｉｒＡ。初步验证后将该质 粒转化至大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ中，利用０．１ｍｍｏｌ／Ｌ的ＩＰＴＧ和８０ ｍｏｌ／Ｌ的生物素进行诱 μ 导表达，采用ＮｉＮＴＡ亲和层析和超滤对ＨｅｘＤ进行纯化，ＳＤＳＰＡＧＥ检测分子量的大小（６０ｋＤａ） 和纯度（９０％以上）。以ａｎｔｉＨｅｘＤ和链霉亲和素ＨＲＰ为抗体，Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测发现，ＨｅｘＤＢＡＰ 表达正确，且被生物素标记；同时以４ＭＵＯＧａｌＮＡｃ为荧光底物，检测到生物素化标记ＨｅｘＤ的糖 苷酶活性为３．６ｎｍｏｌ／（ｍｉｎ·ｇ），与未标记ＨｅｘＤ的活性（３．０６ｎｍｏｌ／（ｍｉｎ· ｇ））相当。结果表 μ μ 明，可以利用ＢｉｒＡ及其受体多肽，通过共表达质粒ｐＣＤＦＤｕｅｔ１，一步转化、表达和纯化，在大肠杆 菌中进行外源蛋白的表达和生物素标记，且不改变目的蛋白的生物活性，可应用于免疫标记、互 作蛋白的捕获等生物学研究。 关键词　原核表达　生物素标记　己糖苷酶Ｄ 中图分类号　Ｑ５６３ 　　生物素是一种有机小分子，可与亲和素或链霉亲 蛋白的损失较大，且在一定程度上会破坏蛋白质的构 １５ ［１］ 和素特异性紧密结合（解离常数约为 １０ ｍｏｌ／Ｌ） 。 象或功能，不利于后期生物学实验的进行。 利用二者的高亲和性，将生物素标记在靶蛋白上，然后 　　在大肠杆菌细胞内，ＢｉｒＡ以乙酰辅酶Ａ的亚基生物 利用亲和素或链霉亲和素，对靶蛋白进行免疫检 素羧基载体蛋白（ｂｉｏｔｉｎｃａｒｂｏｘｙｌｃａｒｒｉｅｒｐｒｏｔｅｉｎ，ＢＣＣＰ）为 ［２３］ ［４］ ［５］ 测 、富集 和互作蛋白分析 ，是常用的生物学方 底物，将生物素特异地添加到ＢＣＣＰ赖氨酸残基的  ε 法之一。虽然蛋白质的生物素化是细胞内天然存在的 ［８９］