实时荧光定量pcr检测感病蝗虫体内绿僵菌rdna基因3.pdfVIP

中国生物工程杂志 　Ch ina B iotechno logy, 2005, 25 ( 11) : 7 1～75 实时荧光定量 PCR检测感病蝗虫 体内绿僵菌 rD NA 基因 张清平 1, 2 　彭国雄 1, 2 , 3 　王中康 1, 2 , 3 　殷幼平 1, 2 , 3 　夏玉先 1, 2 , 3 ( 1 重庆大学生物工程学院生物力学与组织工程教育部重点实验室 　重庆 　400030) (2 重庆大学生物工程学院基因工程研究中心　重庆 　400030) ( 3 重庆大学生物工程学院重庆市杀虫真菌工程技术中心　重庆 　400030) ( ) 摘要 　根据绿僵菌 23 S rDNA 的转录间隔区 ITS 和 5. 8S的基因序列 ,设计检测感病蝗虫体内绿 僵菌菌体 DNA 分子的特异引物 ,通过优化感病蝗虫菌体 DNA 快速制备方法 ,建立了基于荧光定 量 PCR 的定量检测体系 。该检测方法专一 、灵敏 ,检测下限为 10p g/μl绿僵菌 ,并且能从刚侵染 48h 的东亚飞蝗血淋巴中 ,早期定量检测到在虫体血淋巴中增殖的绿僵菌的 rDNA 。 关键词 　绿僵菌 　蝗虫 　定量检测 　实时荧光定量 PCR 　　绿僵菌作为蝗虫的重要病原真菌 , 已广泛应用于 内的增殖速率和动态变化 ,对于昆虫病原真菌的致病 ( ) 蝗虫防治 。绿僵菌生物制剂已被世界粮农组织 FAO 机理研究、真菌生防制剂配方优化都具有重要意义 。 推荐为环保产品 ,在非洲和澳洲以及中国大面积推广 [ 1, 2 ] 1　材料与方法 应用于蝗虫的生物防治 。类似于触杀性杀虫剂 , 附 着在虫体表面的绿僵菌孢子必须萌发 、形成芽管和附 1. 1　材 　料 着胞 ,穿透寄主体壁侵入蝗虫体内, 以菌丝段或虫菌体 ( ) 　　供试菌株 : 绿僵菌 M eta rh iz ium an isop liae 菌株 等形态存在于寄主的血淋巴中[ 3 ] 。虽然昆虫病原真菌 CQM a102 ,为杀蝗专一菌株 ,分离 自重庆缙云山自然感 的致病机制十分复杂 ,但是病原真菌菌体在寄主体 内 ( ) 病的黄脊竹蝗 Ceracris k iangsu ,保存于重庆大学基因 快速增殖是使寄主昆虫罹病 、死亡的前提 ,其增殖数量 工程研究中心 。 及速率直接影响病程及杀虫效率 。病原真菌在寄主体 　　供试蝗虫 : 东亚飞蝗 [L ocus ta m ig ra toria m an ilens is 内的生长繁殖情况能够直接反映致病进程 , 可成为杀 (M ey) ]新羽化雄成虫 , 由重庆大学基因工程研究中心 虫真菌菌株及其制剂毒力评价的重要指标 。传统的真 昆虫室提供 。 菌检测方法难以快速定量检测昆虫体内复杂环境中的 1. 2　试剂与仪器 真菌 ,不能满足相关研究需要 。 ( )