小鼠胚胎干细胞药物代谢酶cyp3a11基因敲除的-中国医药生物技术.pdfVIP

272 中国医药生物技术 2010 年 8 月第 5 卷第 4 期 Chin Med Biotechnol, August 2010, Vol. 5, No. 4 DOI:10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2010.04.007 ·论著· 小鼠胚胎干细胞药物代谢酶 CYP3a11 基因敲除的实验研究 曾军，王雪丁，陈宏远，黄民，杜军 【摘要】 E14 胚胎干细胞（embryo stem cell ，ES cell ）的 目的 研究小鼠胚胎干细胞药物代谢酶 CYP3a11 基因的 CYP3a11 基因进行了敲除，为进一步制作 CYP3a11 敲除。 基因缺陷型小鼠作准备。 方法 根据已知小鼠的 CYP3a11 基因组 DNA 序列，从 129 品系小鼠 E14 胚胎干细胞基因组 DNA 中，通过 1 材料与方法 PCR 的方法分别获得用于构建基因敲除载体的 0.65 kb 的 1.1 材料 5’-短臂（short arm，SA）和（3.3 + 4 ）kb 的 3’-长臂（long 1.1.1 质粒、菌株和 ES 细胞株 质粒 pBluescript + arm，LA ）片段，通过常规分子克隆技术，构建完成针对小 II SK phagemid 为美国 Stratagene 公司产品； 鼠药物代谢酶 CYP3a11 基因的替代型基因敲除载体 pCR2.1-TOPO 为美国 Invitrogen 公司产品；大肠 pCR-CYP3a11_KO ，并对载体进行酶切鉴定。将线性化的 杆菌 DH5α 由本室保存；129 品系小鼠 E14 ES pCR-CYP3a11_KO 载体通过电穿孔技术转入 E14 胚胎干 细胞株为中科院上海生化与细胞研究所提供；ES 细胞。G418 药物筛选 4 ~ 6 周直至克隆形成，用 PCR 和 细胞培养及筛选所需要的支持细胞来自其他基因 Southern blot 技术对筛选出的细胞克隆进行鉴定。 敲除小鼠孕 12.5 d 原代培养的胚胎成纤维细胞 结果 酶切结果表明基因敲除载体 pCR-CYP3a11_KO （mouse embryo fibroblast ，MEF ）。 DNA 序列正确；转染后的 E14 胚胎干细胞经过 G418 筛 1.1.2 工具酶、试剂盒及其他试剂 所有引物均 选后，存活的细胞可形成单克隆集落，经过 PCR 和 为上海生工生物工程技术服务有限公司产品；限制 性内切酶、T DNA 聚合酶、T DNA 连接酶、Taq Southern blot 技术鉴定，其中有 5 个单克隆被证实 CYP3a11 4 4 基因已被敲除。 酶和 PfuUltra™ 酶分别购自美国 Promega 、NEB 、 Stratagene 公司；pfu T/A 克隆试剂盒为上海生物工 结论 成功构建了小鼠 CYP3a11 基因敲除载体，并在小鼠 程公司产品；QIAEX II 凝胶回收试剂盒为德国 E14 胚胎干细胞的 CYP3a11 基因敲除中获得阳性克隆。 QIAGEN 公司产品；Ganc 和 G418 sulfate 购自美 【关键词】胚胎干细胞； 细胞色素 P450 CYP3A ； 小