透析液内毒素.ppt

细菌内毒素试验 中检所 陈丹丹 2006年11月26日 细菌内毒素 与热原的关系: 热原是指能使哺乳类动物产生热原反应的物质。细菌内毒素是革兰氏阴性菌细胞壁的构成成分，具有多种生物活性，它的化学结构是脂多糖(LPS)。 内毒素是主要的热原物质。 细菌内毒素 细菌内毒素 性质: 在250摄氏度干热1小时才能灭活 -----实验器具的准备 多糖链有亲水性,脂肪链有疏水性,在水中呈不均匀分布 -----旋涡混合器混合一定时间 鲎试剂 鲎是四亿年前就存在的古老海洋生物，是无脊椎动物，具有蓝色的血液。 保护： 生长慢，捕杀多，资源濒临灭绝，采鲎血后要及时放归大海。 鲎试剂 鲎试剂 细菌内毒素检查法 本法是利用鲎试剂与细菌内毒素产生凝集 反应（凝胶法）的机理，以判断供试品中含有 的细菌内毒素的量是否符合规定（在限值以内）的一种方法。  试验材料与仪器 试剂： 75%乙醇、鲎试剂、细菌内毒素工作标准品（WSE）、细菌内毒素检查用水（BET水）。 用具： 移液管（或刻度吸管，定量移液器）、吸头、三角瓶、试管（16 mm×100mm）、试管架、封口膜、时钟、吸水纸、剪刀、砂轮。 仪器： 天平、电热干燥箱、漩涡混合器、温度计、恒温水浴箱或适宜的恒温器。 试验前的准备 测温仪或温度计每3-6个月校验一次,不符合要求者不能使用；凡与供试液接触的器皿用洗涤剂清洗，并用自来水冲洗干净，沥干水份再用新鲜蒸馏水冲洗，清洗干净的玻璃器皿、注射器、针头、直镊等放入金属制容器内，密闭，电热干燥箱中经250℃1小时或180℃2小时除热原。去除热原未曾开启的密封容器内的用具，可供一周内使用。 供试液的制备 浓缩液：直接取样成供试液 干粉：称取样品5克，用细菌内毒素检查用水按使用说明的比例配制。 供试液在2小时内备用。 鲎试剂灵敏度复核 目的： 是确定鲎试剂灵敏度的准确性，以保证检验结果的可靠性及准确性。因此要求每个试验室在将一批新的试剂用于供试品细菌内毒素检查前应进行鲎试剂灵敏度复核。 鲎试剂灵敏度复核 内毒素标准溶液的制备 a)取内毒素工作标准品一支，轻弹瓶壁，使粉末落入瓶底，再用砂轮在瓶颈上部轻轻划痕，75%(V/V)乙醇棉球擦拭后启开，防止玻璃屑落入瓶内。 b)按标准品使用说明书用移液管加入规定量的BET水溶解其内容物，用封口膜将瓶口封严。置漩涡混合器上混合15分钟，然后制备成所需浓度的细菌内毒素标准溶液即2.0λ、1.0λ、0.5λ和0.25λ（λ为所复核鲎试剂的标示灵敏度），每稀释一步均应在漩涡混合器上混合30秒（详细过程请参见使用说明书）。 例如使用细菌内毒素工作标准品(例：内毒素含量为100EU/支)时其稀释方法如下： 复溶：准确吸取BET水1mL加入内毒素工作标准品的安瓿内，用封口膜将瓶口封严，置漩涡混合器上混合15分钟，即为100EU/mL内毒素标准溶液。 稀释：取0.3mL内毒素标准溶液加上2.7mL BET水即为1→10稀释液，得到10EU/mL内毒素标准溶液。 取0.3mL1→10稀释液，加上2.7mLBET水即为1→100稀释液，得到1EU/mL内毒素标准溶液,依次类推。 待复核鲎试剂的准备 a)在制备内毒素标准溶液的同时，取0.1mL/支的鲎试剂18支轻弹瓶壁，使粉末落入瓶底。用砂轮在瓶颈上轻轻划痕，75%(V/V)乙醇棉球擦拭后启开备用，防止玻璃屑落入瓶内，加入0.1mLBET水复溶，使内溶物充分溶解，避免产生气泡。 b)若待复核鲎试剂的规格不是0.1mL/支时，按标示量加入BET水复溶，将复溶后的鲎试剂溶液混匀后分别取0.1mL分配到10 mm×75mm凝集管中，要求至少分配18管备用。 鲎试剂灵敏度复核试验 灵敏度的测定 a) 将已充分溶解的待复核鲎试剂18支(管)放在试管架上，排成5列，其中前4列每列4支(管),第5列2支(管),前4列分别加入2.0λ、1.0λ、0.5λ和0.25λ的内毒素标准溶液,第5列2支(管)分别加入 BET水。内毒素标准溶液和BET水加样量均为0.1mL/支。 b) 加样结束后，用封口膜封口，轻轻混匀，避免产生气泡，连同试管架放入