破色期番茄果实均一化cdna沉默文库的构建和功能基因筛选模型的.pdfVIP

生物化学与生物物理进展 Progress in Biochemistry and Biop hys ics 2009, 36(8): 1079~1083 色期番茄果实均一化cDNA 沉默文库的构建 和功能基因筛选模型的初步建立* 王晓光 马远征 王晓辉 李 玲 罗云波 朱本忠** ( 国农业大学食品科学与营养工程学院食品生物技术实验室，北京 100083) 摘要 番茄果实的成熟是由多基因精细调控的一个过程 利用破色期番茄果实，根据复性动力学原理在mRNA 水平进行均 一化操作使高丰度和低丰度的mRNA 丰度接近 然后把均一化之后mRNA 反转录得到cDNA ，再与基因沉默载体pTRV 重 组，最后把构建好的载体通过电转化的方 转入到GV3101 农杆菌中，从而建立起破色期番茄果实均一化cDNA 沉默文库 通过番茄果实 病毒诱导基因沉默技术，对cDNA 沉默文库进行初步筛选，从而确定功能基因筛选模型 在模型建立阶段， 以番茄红素合成途径相关的PDS 基因作为内标基因，在 100 个混合农杆菌样 ，成功筛选到了PDS 基因 关键词 cDNA 文库，均一化，功能基因，VIGS 学科分类号 Q819 DOI: 10.3724/SP.J.1206.2008.00837 番茄是一个比较重要的经济作物，同时其拥有 研究[15, 16] 相对比较小的基因组和充足的突变体材料，果实具 植物体内除了极少数的持家基因，多数基因在 有明显的成熟阶段，以及遗传图谱比较清晰等优 不同的时期、不同的组织里表达丰度存在着巨大的 势，因此，一直以来人们把番茄作为水果蔬菜成熟 差异，并且有的基因甚至必须在特 的环境条件的 [1] 衰老和乙 作用机理研究的模式材料 随着人 诱导下才表达 基因的转录水平分为高中低三 [2] [3] [4] [17] 类 、拟南芥 、水稻 等基因组测序的进行和完 类 ，并且绝大多数基因是处于 等或者低表达丰 成，番茄基因组测序工作也开始实施，其 我国承 度的 但是高丰度的基因的转录产物在单个细胞 [5] 担了第3 号染色体的测序任务 目前该研究已经 含有5 000 个左右的拷贝，约占总表达量的25% [6] 完成了40% 的测序工作 同时，美国番茄表达序 这就为构建一个具有完整代表性的cDNA 文库增 列标签(expressed sequence tag，EST)测序计划对番 添了障碍，尤其为后续的文库筛选和鉴定带来不必 茄组织cDNA 文库进行测序，这些组织包含了根、 要的浪费 因此，构建一个均一化的cDNA 文库 [7] 是克服转录水平差异的有效措施 叶、茎以及不同成熟时期的番茄果实等 ，目前已 经完成了162 621 条EST 的测序工作，共31 838 1 材料和方法 个基因片段[8] 这些项目研究为推动番茄果实成熟 相关功能基因组学的研究奠定了基础 功能基因组 1.1 材料 学主要研究生物体全基因组或组织系统内所有基因 1.1.1 番茄 丽春番茄破色期果实(L. esc ulentum L. 的生物学功能，从而了解生长发育过程的确切机 cv. Jinfen) ，种植于温室(25℃/20℃，湿度90% ， [9] 光周期 14 h/ 10 h) ，花后40 天，根据番茄果顶刚 制 目前已经发展了多种分析鉴定基因功能的方 [10]