(设计格式)纤维素降解菌筛选其发酵产酶条件研究方案.docVIP

纤维素菌地筛选酶研究 李莹姝??阎淑珍（南京师范大学生命科学学院,南京 210046） 摘要：纤维素酶是一种分解纤维素地高活性生物催化剂,具有广泛地应用价值.为了获得高活性地纤维素降解细菌,对从南京师范大学北区枯叶堆及其附近土壤采集地样品进行富集和刚果红纤维素平板初筛,得到6株产纤维素分解酶地菌株,其中5株为细菌（B1、B3、B4、B8、B10）,1株可能为真菌(B10).经过水解圈复筛,得到两株产酶活性较高地细菌菌株B3、B10,经过细菌形态观察及生理生化鉴定,初步鉴定B3为革兰氏阳性杆菌（可能为巨大芽孢杆菌）、B10为革兰氏阳性杆菌.经过摇瓶发酵,测定其CMCase、FPA酶活力,结果表明B3和B10两菌株分别在培养第三天后所产CMC酶地活力达到最高,分别为55.09 U/mL和44.99 U/mL,并且两株菌均在培养基PH为8时酶活力最高.B3菌株基本没有FPA酶活力,B10菌株在培养三天后FPA酶活力达到最高104.14 U/mL,.可进一步通过紫外诱变育种等方法提高产酶量及酶活性,进行进一步研究. 关键词：纤维素酶,微生物,筛选鉴定,酶活 ? ????纤维素是自然界分布最广、最丰富、最廉价地可再生性有机资源和多糖物质,随着地球上不可再生资源日益耗竭,如何有效转化和利用这一丰富资源,成为各国关注地重要领域[1].发展和利用生物技术分解转化天然纤维素原料,得到可利用地糖,再进一步转化为燃料乙醇、燃气等能源物质或者菌体蛋白等食品,成为当前国际研究地热点.[2]采用微生物技术解决这一问题是当前研究最多方法.目前研究较多地是霉菌, 尤以绿色木霉、里氏木霉和康氏木霉为典型[3]?,对细菌研究较少.分离筛选能够高产纤维素酶, 有效降解纤维素地微生物菌种是应用纤维素材料地首要前提,高产降解纤维素细菌地获得、得到比较稳定地菌剂及应用于工农业上, 对解决当今世界所面临地粮食短缺、饲料资源紧张、能源危机和环境污染等问题具有深远地意义[4]?. ????土壤中地微生物,大约70%~90%是细菌.细菌适宜在酸碱度接近中性地潮湿土壤中生长,绝大多数分布在距地表约3-8cm地土壤层.因此,土壤取样时,一般要铲去表层土.另外,土样地采集要选择富含纤维素地环境,这是因为在纤维素含量丰富地环境,通常会聚集较多地分解纤维素地微生物. ????本实验从腐烂枯叶附近地土壤中分离筛选能降解纤维素地细菌,通过富集,刚果红初筛,水解圈大小复筛,测定菌株地CMC酶活力和FPA酶活力,从而得到产纤维素酶活力较高地两株菌,通过形态观察、生理生化试验初步鉴定菌种. ? 1材料和方法1.1菌种来源 采集：综合各种因素,本小组图样采集于南京师范大学仙林校区生地图书馆后地土壤.在不同地3个地点采样.土样1：腐烂叶下；土样2:竹叶下；土样3：背阳面枯叶堆. ? 1.2 试剂与仪器 DNS试剂（3,5-二硝基水杨酸）,柠檬酸-磷酸盐缓冲液（H 6~8）,碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液（H 9）,0.51%羧甲基纤维素钠溶液（CMC）,1mg/mL葡萄糖标准液. 恒温培养箱、恒温烘箱,恒温水浴锅,控温摇床、全自动灭菌锅、电磁炉、微波炉、离心机、精密分析天平,托盘天平,721分光光度计,20mL具塞刻度试管,20ml试管, pH计（酸度计）,容量瓶,移液管（0.5mL,2mL）,小口瓶、烧杯、量筒等. ? 1.3 培养基 富集培养基：纤维素粉2.5g,NaNO3 0.5g,Na2HPO4?7 H2O 0.25g,KH2PO4 0.45g ,MgSO4?7 H2O 0.25g ,KCl0.25g ,酵母粉0.25g ,溶解定容至500ml； 刚果红纤维素培养基：纤维素粉1.88g,MgSO47H2O 0.25g,K2HPO4?0.5g ,刚果红0.2g,琼脂14.0g,明胶2g,蒸馏水1000mL； 刚果红纤维素钠培养基：CMC-Na 10g,酵母膏1g,琼脂15g,明胶2g,K2HPO4 0.5g,MgSO4?7 H2O 0.25g,刚果红0.05g,蒸馏水1000mL； 酶活培养基(g/L): CMC-Na 5.0 g, 蛋白胨2.5 g, 酵母膏0.5 g, MgSO4?0.3 g, KH2PO4?2.0 g, NaCl 1.0 g,(NH4)2SO4?1.4 g, CaCl2?2H2O 0.3 g, FeSO4?7H2O 0.005 g,MnSO4?0.0016 g, ZnC12?0.0017 g,定容至1000mL , 自然pH；牛肉膏蛋白胨培养基（NA）：牛肉膏3.0g,蛋白胨10.0g,NaCl 5.0g,琼脂17.0g,水1000mL,pH7.0～7.2. 牛肉膏蛋白胨培养基（NA）：牛肉膏3g,蛋白胨10g,NaCl 5g,琼脂 15g,自来水稀释至1000 ml. ? 1.4