广东惠州地区慢性乙肝患者乙肝病毒基因型与HBVcccDNA含量关系探究.docVIP

广东惠州地区慢性乙肝患者乙肝病毒基因型与HBVcccDNA含量关系探究 　　[摘要] 目的 探讨广东惠州地区慢性乙型肝炎（乙肝）患者基因型及HBVcccDNA含量水平及关系。方法 利用患者血清为材料，通过HBV基因型特异性引物PCR方法检测HBV-DNA阳性标本的基因型，同时用荧光定量PCR方法对HBVcccDNA含量进行检测。 结果 123例慢性乙肝病毒感染者中，HBV B型91例（73.98%）、C型28例（22.76%）、B、C混合型1例（0.81%），未能确定基因型3例；HBVcccDNA检测阳性为66例，阳性率为53.66%，57例无法检测到HBVcccDNA含量。 结论 惠州地区慢性乙型肝炎患者HBV基因型以B 型和C型多见，B、C混合型较少，基因型与HBVcccDNA含量没有直接关系。 [关键词] 慢性乙型肝炎；基因型；乙肝病毒共价闭合环状DNA [中图分类号] R512.6+2 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2013）09（b）-0174-02 乙型肝炎（乙肝）病毒（HBV）感染是一种严重威胁人类健康的传染性疾病，可引起慢性肝病、肝硬化、肝细胞癌的发生，是全球性的公共卫生问题，在我国危害尤其严重，国内约有1.2亿慢性HBV感染者，全国每年死于HBV感染相关肝病者约30万例。国内乙型肝炎病毒感染者中，慢性乙肝（CHB）患者约3000万人，如治疗不恰当可进一步发展为肝硬化、肝癌。根据HBV全基因序列异质性≥8%的标准，目前将HBV分为A～H 8个基因型，研究表明HBV基因型与病情轻重有关[1-2]。既往流行病学调查报道我国的HBV基因型北方以C型为主，南方以B型为主。肝炎病毒是通过DNA复制进行扩增的，其HBVcccDNA的全称是乙肝病毒共价闭合环状DNA，是HBV前基因组RNA复制的原始合成模板，是HBV持续感染的关键因素，对于HBV的复制以及感染状态的建立具有十分重要的意义。HBVcccDNA含量是HBV复制最特异的指标，其灵敏性和准确性都要超过目前常用的HBV DNA检测。为了进一步探明惠州地区慢性乙型肝炎感染者的基因型及其通过分子生物学来判断病情轻重，笔者选取乙肝患者血清进行基因型的检测及cccDNA的定量测定工作，以期为诊治工作提供指导。 1 资料与方法 1.1 一般资料 选择2011年1月～2012年12月中信惠州医院住院和门诊HBV感染患者（HBV-DNA阳性）123例，收集患者血清标本，其中，男性98例，女性25例，平均年龄（49.1±17.1）岁，疾病的诊断依据参照中华医学会2000年全国肝炎会议拟定的方案[3]，并排除重叠甲、丙、戊型肝炎病毒感染。 1.2 检测方法 1.2.1 HBV基因型检测 实时荧光PCR引物探针设计采用Primer Primer 5软件进行。HBV-DNA基因分型检测应用实时荧光PCR法，应用南方医科大学提供的PCR buffer和Taq酶，对已知HBV-DNA阳性标本进行基因分型。①取处理液A 100 μl于0.5 ml离心管内，加待检血清100 μl混匀，13 000 r/min离心10 min。②弃上清液，加入处理液B 25 μl，100℃煮沸10 min，13 000 r/min离心10 min。③取上清2 μl于各型基因型反应液管内，弹匀，10 000 r/min离心10 s。④上机，预变性94℃ 2 min，循环条件：94℃ 50 s，55℃ 50 s，72℃65 s，共循环40次。⑤最后72℃延伸3 min（阴性、阳性参照同标本处理）。结果判定按实时荧光PCR的扩增曲线进行判读，对应类型样孔呈阳性结果，则所检病毒基因为该型。 1.2.2 HBVcccDNA定量检测 采用广州华银生物科技有限公司的实时荧光PCR定量检测试剂盒，按照操作说明书进行检测。 1.3 统计学处理 采用SPSS 10.0软件包，HBV DNA水平先行方差齐性检验，然后进行单因素方差分析进行两两比较，以P 　　HBVcccDNA是乙型肝炎病毒复制的中间体，是病毒RNA转录的模板。肝细胞内存在cccDNA是HBV复制的最直接证据。有学者研究认为，CHB患者血清中出现cccDNA是肝脏损害的标志，可以反映病情的轻重及病情的进展[5]。同时也反映了实时荧光定量PCR法检测CHB患者血清HBVcccDNA灵敏性较高，特异性强，可以应用于临床监测乙肝患者血清中HBVcccDNA的水平及动态变化，可较准确地提供HBV复制状况，对临床进行乙肝诊断、抗病毒治疗效果评价、预后观察判断具有重要的价值，同时在判断血液或器官是否具有传染性方面存在血清学标志物检测无法比拟的优越性[6]。有学者研究发现血清HBVc