生物技术及应用实验.docVIP

目 录 实验一 柠檬酸产生菌的分离及初筛 实验二 柠檬酸产生菌的复筛 实验三 应用正交实验法优选柠檬酸产生菌的最佳发酵培基 实验四 柠檬酸产生菌的发酵 实验五 柠檬酸的提取 实验六 柠檬酸发酵产物及提取产品的检测、鉴定 实验七 蛋白酶活力的测定方法原麦汁浓度（蒸馏——密度法） 柠檬酸产生菌的分离及初筛 一、实验目的： 1、了解黑曲霉菌在工业生产中的不同作用； 2、复习掌握从土壤中分离工业用微生物的原理 及方法； 3、掌握利用变色圈法筛选产酸菌的方法。 二、实验原理 1、新菌株的分离大致可分为采样、增殖（富集）培养，分离鉴定、性能测定等步骤。 2柠檬酸可由曲霉菌发酵糖类而生成，其中尤以黑曲霉产酸能力最强。目前工业生产中多以黑曲霉为柠檬酸产生菌。 3、黑曲霉耐酸性较强，在pH值1.6时仍能良好生长。利用其产酸高、耐酸强的生理特征，使用pH1.6的酸性营养滤纸分离该菌，简单易行，再加上用变色圈法进行初筛，使产柠檬酸的菌株更易被选出。 4、黑曲霉产生的柠檬酸,可利用Deniges氏液鉴别；其产酸量可用0.1N氢氧化钠滴定。 柠檬酸产生菌的分离实验步骤: 1、土壤采样 2、准备稀释分离用的器材 3、将平皿、吸管包好后干热灭菌 4、配制察氏培养基 5、做成固体斜面 6、配成蓝色的察氏-多民培养基 7、湿热灭菌 8、摆斜面、倒平板 9、稀释土样 10、涂布均匀 11、倒置培养。 柠檬酸产生菌的初筛实验步骤 1、配制初筛发酵培养基并灭菌 2、观察菌落 3、挑选菌落变色圈，测量变色圈与菌落直径之比，取比值较大者 4、将选好的菌株编号，接入斜面。同时采用倒置接种法在培养皿上点植接种 5、培养斜面和平皿 6、摇瓶发酵 7、柠檬酸鉴定 8、产酸量的测定。 思考题 1.简述从土壤中筛选产目的产物微生物菌种的过程。 2.土壤采样时应注意的哪些问题？ 3.黑曲霉柠檬酸产生菌菌株的富集应考虑利用哪些特点来进行富集？ 实验二 柠檬酸产生菌的复筛 一、实验目的 1.掌握以初筛的菌株为基础进行选优的复筛方法； 2.掌握摇瓶发酵的方法。 二、实验原理 初筛选出的菌株必须进行摇瓶发酵复筛，复筛不是初筛简单的重复。 复筛的主要目的： ①考查菌株生产能力的自然波动范围； ②复筛的菌种经过斜面传代，在摇瓶复筛中考查菌种的传代稳定性； ③选出稳定、高产的菌株 三、实验步骤 1. 将各菌种的孢子接种蔗糖培养基中，同时作对照实验 2.将实验组和对照组摇瓶振荡发酵培养 3.发酵结束后，测定并计算出空白对照和各菌种的平均产酸率 4.选取产酸率高且稳定的菌株 思考题 1.为什么在平板初筛中有些菌落透明圈或显色圈很大，但摇瓶发酵试验结果产酸甚低？ 2.复筛中应该注意那些事项。 实验三 应用正交实验法优选柠檬酸产生菌的最佳发酵培养基 实验目的 1.掌握利用正交实验优选最佳发酵培养基的方法； 2.掌握极差法分析正交试验结果的方法。 实验原理 正交设计是利用一套规格化的表格—正交表，科学合理地安排试验。这种设计的特点是在试验的全部处理组合中，仅挑选部分有代表性的水平组合进行试验。通过这部分试验了解全面试验情况，找到较优的水平组合。 正交表是正交设计的基本工具。在正交设计中，安排试验，分析结果，均在正交表上进行。 正交试验法：是利用正交表挑选出一部分有代表性的试验，所以减少了试验次数，另外用其进行整体设计，可以同时做一批试验以缩短试验周期，用该法通过极差分析、方差分析，还能告诉我们那些因素是试验指标的主、次因素，因素间有交互作用及交互作用的大小，分析出试验的误差大小，对所做试验的误差大小等有个数量的概念。 实验步骤 1.确定试验因素和水平数 根据试验的目的确定试验要研究的因素。为提高柠檬酸产生菌的产酸率， 据资料查阅或经验，常用的柠檬酸发酵培养基为：蔗糖15%，NH4NO30.2%，KH2PO4 0.1%，MgSO4·7H2O 0.25%。将其定为基础发酵培养基，并以它确定了四个因素，每个因素各三个水平，如下表所示… 2.选用合适的正交表 根据试验因素和水平数的多少以及是否需要估计互作来选择 合适的正交表。如下表所示 因素水平表 因素 水平 蔗糖（%） NH4NO3 （%） KH2PO4 （%） MgSO4·7H2O （%） A B C D 1 10 0.1 0.05 0.1 2 15 0.2 0.1 0.25 3 20 0.3 02 0.5 L9(34)的正交表 列号 实验号 A（蔗糖） 1因素 B（ NH4NO3 ） 2因素 C（ KH2PO4 ） 3因素 D（MgSO4）4因素 产酸率（%） 1 1（10%） 1（0.1%） 1（0.05%） 1（0.1%） X1 ,