冬凌草hmgs基因的克隆与表达分析-中国作物学会.pdfVIP

总第174期 25 作物杂志 Crops 2016（5）：25-30 DOI：10.16035/j.issn.1001-7283.2016.05.005 冬凌草HMGS 基因的克隆与表达分析 1,2 1 1,2 1,2 1,2 朱畇昊 爼梦航 苏秀红 董诚明 陈随清 1 2 （ 河南中医学院药学院，450046，河南郑州； 呼吸疾病诊疗与新药研发河南省协同创新中心，450046，河南郑州） 摘 要 羟甲基戊二酰辅酶Ａ合酶（3-Hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A synthase，HMGS）是甲羟戊酸途 径（MVA）中的第一个催化酶。根据冬凌草转录组数据库中 HMGS 基因序列设计特异引物，采用 RT-PCR 技术克隆冬凌草 IrHMGS 基因 cDNA 全长，并对其序列进行生物信息学分析，通过荧光定量 PCR 的方法分 析其组织表达特性。IrHMGS 基因 cDNA 全长 1 382bp，编码 460 个氨基酸，序列分析结果表明该基因编码的 氨基酸序列含有羟甲基戊二酰辅酶 A 合成酶 N 末端、C 末端等保守结构域。荧光定量 PCR 表明，IrHMGS 在冬凌草组培苗叶和根中的表达量显著高于在组培苗花、茎和愈伤组织中的表达量。本研究为后续深入研究 IrHMGS 在冬凌草二萜类物质合成途径中的功能奠定了基础。 关键词 冬凌草；HMGS 基因；生物信息学分析；荧光定量 PCR 冬凌草 [Isodon rubescen（Hemsl.） H.Haras] 为唇 基因，如丹参 [8] 、喜树 [9] 、灵芝 [10] 等，而有关冬凌 形科香茶菜属植物碎米桠变种，野生冬凌草主要分 草 HMGS 基因的研究尚未见报道。本研究通过生物 布于太行山南部，尤以河南省济源市附近生长的冬 信息学及组织特异性分析初步判断 HMGS 基因可能 凌草品质较佳。冬凌草自古以来被太行山区的民间 与二萜类化合物合成有关，为进一步探讨其在冬凌 常年当作茶叶饮用，因其具有清热解毒、清咽利喉、 草二萜类成分生物合成中的作用奠定基础。 消炎止痛的功能在当地非常盛行 [1-2] 。目前，已经 1 材料与方法 开发出冬凌草糖浆、冬凌草保健饮料、冬凌草茶叶、 冬凌草爽口液等产品，提高了冬凌草的利用率，也 1.1 材料与试剂 带动了农民种植冬凌草的积极性。张覃沐等 [3] 、孙 试验于 2015 年在河南中医学院生药学科分子 汉董等 [4] 对冬凌草进行了系统的化学成分分析，发 生物学实验室完成。试验材料为冬凌草组培苗、愈 现冬凌草中主要的活性成分为对映贝壳杉烯类二 伤组织，由本实验室继代保存，经董诚明教授鉴定 萜，且河南济源所产冬凌草中富含的冬凌草甲素、 为碎米桠变种 Isodon rubescens（Hemsl.） H.Hara。 [5-6] 乙素等均具有良好的抗肿瘤效果 。 1.2 方法 随着分子生物学的发展，萜类化合物生物合成 1.2.1 总 RNA 提取与 cDNA 的合成 取高度约 途径相关酶类的编码基因被不断克隆与研究。羟甲 10cm 的冬凌草组培苗，摘取叶片，迅速加液氮研磨， 基戊二酰辅酶Ａ合酶（3-Hydroxy-3-methylglutaryl-