基于ires序列的多基因共表达载体构建.pdfVIP

中国生物工程杂志　ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１７，３７（７）：９７１０４ ＤＯＩ：１０．１３５２３／ｊ．ｃｂ 基于ＩＲＥＳ序列的多基因共表达载体构建 １ １ １ ２ １ １ 田聪慧 　谢雪梅 　李　英 　尹晓东 　韩　军 　李　军 （１聊城大学药学院　生物制药研究院　聊城　２５２０００　２宜兴市赛尔生物科技有限公司　宜兴　２１４２００） 摘要　目的：构建一个ＩＲＥＳ序列介导的多基因共表达载体，实现两个目的基因和筛选标记基因 共用一个启动子高效表达，提高多基因稳定共表达细胞株的筛选效率。方法：以实验室前期构建 的载体ｐＬＶＭＣＳＰｕｒｏ为骨架，设计并全基因合成双基因克隆表达元件，连接到骨架载体，构建多 基因共表达载体ｐＬＶ２ＭＣＳＰｕｒｏ，以ＤｓＲｅｄ２和ＥＧＦＰ荧光蛋白基因验证该载体用于多基因稳定 共表达细胞株筛选的效率。结果：成功构建了ｐＬＶ２ＭＣＳＰｕｒｏ载体以及 ＤｓＲｅｄ２和ＥＧＦＰ共表达 重组质粒ｐＬＶＤｓＲｅｄ２ＥＧＦＰＰｕｒｏ。瞬时转染实验证明该载体能介导多基因共表达。抗性筛选获 得了ＭＤＣＫ和ＨｅＬａ两种细胞的多基因稳定共表达细胞池。细胞池涂片荧光显微镜观察和计数 表明抗性细胞池ＤｓＲｅｄ２和ＥＧＦＰ双阳率接近１００％。基因组和转录水平ＰＣＲ及蛋白质免疫印迹 实验表明，ＤｓＲｅｄ２和ＥＧＦＰ稳定整合到抗性细胞基因组，并且两种蛋白质表达水平较为一致。结 论：成功构建了多基因共表达载体ｐＬＶ２ＭＣＳＰｕｒｏ，实现了两个目的基因和抗性基因串联共表达， 并且具有高效的多基因稳定共表达细胞株筛选效率。该载体在研究蛋白质相互作用及工程细胞 构建等方面具有一定的应用前景。 关键词　ＩＲＥＳ　载体构建　基因共表达 中图分类号　Ｑ７８２ ［４９］ 　　科学研究中构建稳定表达细胞株，抗体工程和细 ５′ＵＴＲ中，允许 ＲＮＡ以５′帽子非依赖性方式翻译 。 胞工程领域筛选种子细胞经常需要实现两个或以上的 利用 ＩＲＥＳ连接两个基因，在上游启动子的控制下， 基因稳定共表达。通常通过两个载体共转染的筛选方 ＩＲＥＳ和两个基因转录成为同一条ｍＲＮＡ，翻译时，ＩＲＥＳ 法来实现，然而实践中常面对以下问题： 两个载体共 上游基因翻译起始遵循真核生物基因的帽依赖性方 ① 转染需要两种筛选标记； 两个载体的共转染效率，整 式，而下游基因则通过ＩＲＥＳ招募核糖体进入起始基因 ② 合效率和目的基因的共表达效率及表达稳定性存在差 的翻译，实现了ＩＲＥＳ序列连接的两个基因共用同一个 异［１］； 筛选标记基因与目的基因的共整合效率。以 转录单位表达［１０１２］。目前，已经有较多利用ＩＲＥＳ序列 ③ 上问题为筛选合适的稳定表达细胞株在效率、时间和 连接两个目的基因，实现双基因的瞬时表达或者稳定 人工成本等方面提出了挑战。因此，有必要开发单个 表达细胞株构建的研究［１３１８］。但是使用唯一启动子， 载体实现多基因共同表达来解决以上问题。 利用２个或以上ＩＲＥＳ序列串联２个或者以上目的基因 　　ＩＲＥＳ（ｉｎｔｅｒｎａｌｒｉｂｏｓｏｍｅｅｎｔｒｙｓｉｔｅ）序列是于１９８８年 和抗性基因共表达，以提高多基因稳定共表达细胞株 分别由ＮａｈｕｍＳｏｎｅｎｂｅｒｇ和ＥｃｋａｒｄＷｉｍｍｅｒ实验室在脊 的筛选效率的研究未见报道。 ［２］ ［３］ 　　本研究在实验室前期构建的慢病毒表达载体ｐＬＶ 髓灰质炎病毒（ＰＶ） 和脑心肌炎病毒（ＥＭＣＶ） 的 ＲＮＡ基因组中发现。ＩＲＥＳ通常位于 ＲＮＡ病毒的