斑点叉尾leap2成熟肽在毕赤酵母中的表达及其-上海海洋大学学报.pdfVIP

文章编号：１６７４５５６６（２０１７）０１００２３０８ ＤＯＩ：１０．１２０２４／ｊｓｏｕ．２０１６０４０１７５９ 斑点叉尾 ＬＥＡＰ２成熟肽在毕赤酵母中的表达及其抑菌活性 １，２ １，２ １，２ 孙立人 ，陶　妍 ，高　北 （１．上海海洋大学 食品学院，上海　２０１３０６；２．上海水产品加工及贮藏工程技术研究中心，上海　２０１３０６） 摘　要：ＬＥＡＰ２（Ｌｉｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｅｄａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌｐｅｐｔｉｄｅ２）抗菌肽是一类主要在动物肝脏中表达的小分子肽，它 们在动物的免疫系统中发挥了重要作用。斑点叉尾 （Ｉｃｔａｌｕｒｕｓｐｕｎｃｔａｔｕｓ）ＬＥＡＰ２的一级结构由信号肽和原 前体肽组成；原前体肽由６６个氨基酸残基组成，近羧基端的４１个残基组成了其成熟肽区域（ｍＬＥＡＰ２），该区 域决定了ＬＥＡＰ２的生物学活性。本文以斑点叉尾 ｍＬＥＡＰ２为研究对象，通过建立毕赤酵母表达系统，实现 了ｍＬＥＡＰ２在毕赤酵母中的重组ＤＮＡ表达，优化的表达条件为：２９℃、ｐＨ６、２５０ｒ／ｍｉｎ、０．５％甲醇、１２０ｈ。 ＴｒｉｃｉｎｅＳＤＳＰＡＧＥ分析表明：表达产物经固化金属离子亲和层析（ＩＭＡＣ）纯化后，获得了高纯度的目的蛋白。 经Ｆｏｌｉｎ酚法测定，纯化产物的浓度为０．２２ｍｇ／ｍＬ，推算至表达量为２．２ｍｇ／Ｌ。进一步通过ＭＡＬＤＩＴＯＦ／ＴＯＦ 质谱分析对纯化产物的结构进行鉴定，结果证明：获得的纯化产物为预期的重组体ｍＬＥＡＰ２（ｒｍＬＥＡＰ２）。此 外，抑菌实验结果显示ｒｍＬＥＡＰ２具有明显的抑制枯草芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）的活性。 关键词：斑点叉尾 ；ＬＥＡＰ２成熟肽；毕赤酵母；重组ＤＮＡ表达 中图分类号：Ｓ９１７　　　文献标志码：Ａ 　　抗菌肽是动物先天免疫系统的重要组成成 ＬＥＡＰ２基因外源表达方面的研究报道较少，已有 分，其分子量一般为１．５～１０ｋｕ，它们对细菌、真 的报道大多数也是基于大肠杆菌原核表达系统 菌、有包膜的病毒乃至癌细胞等均有抑制作用， 的重组 ＤＮＡ表达，例如斑点叉尾［１０１１］、大黄 ［１２］ ［７］ ［２］ 故又被称为动物的“第二防御体系” ，也因此 鱼 和人类 ＬＥＡＰ２基因在大肠杆菌中的表达； 被认为是替代抗生素的良好候选者。ＬＥＡＰ２ 至于ＬＥＡＰ２基因真核表达方面的研究报道则更 （Ｌｉｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｅｄａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌｐｅｐｔｉｄｅ２）抗菌肽是 ［１２］ 少，仅王红亮 报道了小鼠ＬＥＡＰ２基因在毕赤 一类主要在动物肝脏中表达的小分子肽，最初是 酵母中的表达，而鱼类来源ＬＥＡＰ２基因的真核重 从人血液超滤产物中得到［３］，被发现能抵抗革兰 组ＤＮＡ表达还未见报道。 氏阳性的巨大芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、枯 本研究室在过去的几年中以斑点叉尾 草芽孢杆菌 （Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）、藤黄微球菌 ＬＥＡＰ２抗菌肽为研究对象，开展了重组 ＤＮＡ表 （Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ ｌｕｔｅｕｓ）、金 黄 色 葡 萄 球 菌 达方面的研究，旨在开发用于替代抗生素的绿色 （Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓｃａｒｎｏｓｕｓ）和革兰氏阴性的灰色奈 饲料添加剂。就ＬＥＡＰ２的结构而言，除去信号肽 瑟菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａｃｉｎｅｒｅａ）等细菌。鱼类中的ＬＥＡＰ２ 之后的原前体肽由６６个氨基酸残基组成，近羧 ［４］ 基因首次发现于虹鳟（Ｏｎｃｏｒｈｙｎｃｈｕｓｍｙｋｉｓｓ） ， 基端的４１个残基为成熟肽区域，该区域决定了 目前，多种鱼类的ＬＥＡＰ２基因已经被相继分离和