稻瘟菌蛋白激发子基因pemg植物表达载体的构建及其转化烟草-维普.pdfVIP

分子植物育种，2008年，第 6卷，第 3期，第 419—424页 MolecularPlantBreeding，2008，Vo1．6，No．3，419-424 研究报告 ResearchReport 稻瘟菌蛋白激发子基因pemG 植物表达载体的构建及其转化烟草的研究 毛建军 曾洪梅 杨秀芬 袁京京 邱德文 ’ 中国农业科学院植物保护研究所，植物病虫害生物学国家重点实验室，北京，100081 通讯作者，dewenqiu@hotmail．com 摘 要 设计含 uI酶切位点的接头，将其连接入经 凡I和BamHI酶切后的质粒pCAMBIA2300一U— bi—Ocs，得到pCAMBIA2300一Ubi—adaptor—Ocs。设计含有 凡I和MluI酶切位点的引物，以稻瘟菌基因组 DNA为模板扩增得到peraG1序列。将其连接入pMD18一T得到pMD18一T-pemG1。最后，用 凡I和M／uI 从pMDI8一T—pemG1切下pemG1基因片段，将其连接入pCAMBIA2300一Ubi—adaptor—Ocs的 凡I删 uI酶 切位点，构建成稻瘟菌蛋 白激发子基因peraG1的植物表达载体体pCAMBIA2300一Ubi-pemG1一Ocs。用冻融 法将pCAMBIA2300一Ubi-peraG1一Ocs导入根癌农杆菌菌株AGL-1，再通过根癌农杆菌介导转化获得 了转基 因烟草株系。用PCR，Northern和Western杂交验证 了pemG1基因在受体烟草基因组中的整合，转录和表 达。此研究为下一步通过稻瘟菌蛋白激发子基因pemG1的表达来提高转基因烟草的抗病性打下了基础。 关键词 烟草，蛋白激发子，植物表达载体，遗传转化 ConstructionofPlantExpressionVectorforE1icitOr_encOdingGenepemG1 fromMagnaporthegriseaanditsTransformationtoTabacco MaoJianjun ZengHongmeiYangXiufen YuanJingiing QiuDewen’ TheStateKeyLaboratoryforBiologyofPlantDiseasesna dInsectPests，InstituteofPlnatProtection，ChineseAcademyofAgriculturalSciences，Bei· jing，100081 ‘ Correspondingauthor,dewenqiu@hotmail．tom Abstract AnadaptorharboringMluIrestrictionsitewasdesignedandclonedinto 凡I—BamHIsiteofpCAM— BIA2300一Ubi—OcsplasmidtogetpCAMBIA2300一Ubi—aadptor-Ocs．PrimerpairharboringrpnIandM／uIsites wasalsodesignedtoamplifyMagnaporthe e口DNA templatetogetpemG1sequence，whichWas clonedinto pMDI8一TvectortoformpMDI8一T—pemG1．Finally,therpnI—M／uIrfagmentofpemG1rfompMDI8一T-pemG1 wasclonedatKpnI—M／uIsiteofpCAMBIA2300一Ubi—aadptor—Ocstoofmr plantexpressionvectorpCAMBI— A2300一Ubi-pemG1一Ocs．TheexpressionvectorconstructwastransferedtoAgrobacterium tumefaciensAGL-1 srtainbyrfeeze—thaw mehtod．TransgenictobaccolineswereproducedbyAgrobacterium—mediatedtransfomr ation． Integration，rtanscriptionandexpressionofpemG1intobaccowererespectivelyconfimr edbyPCR,Northern blot