高效絮凝素毕赤酵母表面展示系统的构建-生物化学与生物物理进展.pdfVIP

生物化学与生物物理进展 Progress in Biochemistry and Biop hys ics 2010, 37(2): 200~207 效絮凝素毕赤酵母表面展示系统的构建* ** 韩双艳 韩振林 林 影 郑穗平 (华南理工大学生物科学与工程学院，广州510006) 摘要 为了获得高效的脂肪酶毕赤酵母表面展示系统，利用来自酿酒酵母絮凝素蛋白Flo1 的N 端874 个氨基酸残基(FS)和 C 端的 1 101 个氨基酸残基(FL)作为锚定蛋白分别构建了2 套载体系统 带有前肽的米黑根毛霉脂肪酶(ProRML)克隆到构建 的2 套展示载体中，使米黑根毛霉脂肪酶(RML)分别以N 端锚定或C 端锚定的方式实现在毕赤酵母细胞表面的展示 利用 RML C 端的Flag 标签，通过流式细胞术和激光扫描 聚焦显微镜检测2 套系统中RML 在酵母表面的展示情况 研究发现， N 端锚定于酵母表面的展示酶FSR 以pNPC 为底物时，水解活力达到了105.3 U/g ，大约为C 端锚定的展示酶FLR 活力的2 倍 同时FSR 比FLR 具有更宽的温度、pH 作用范围和更好的热稳定性 与游离酶和固定化酶相比，展示酶FSR 也表现出 更为优良的热稳定性 结果提示，基于Flo 1 N 端锚定的展示系统更适合展示活性中心近C 端的脂肪酶，推动了展示酶的进 一步研究和开发 关键词 酵母表面展示，毕赤酵母，米黑根毛霉脂肪酶，N 端锚定系统，C 端锚定系统 学科分类号 Q814.4，Q785 DOI: 10.3724/SP.J.1206.2009.00484 米黑根毛霉脂肪酶(R hizomucor miehei lipase， 突破上述瓶颈有重要意义 RML)是一条 /茁 型单链多肽，由269 个氨基酸残 絮凝素Flo1p ( flocculation protein flo1p) 由FL O1 [1] 基组成 ，有着明显的界面激活效应，固定化的 编码，是一种在絮凝中起重要作用的酵母细胞壁 RML 可在非水相反应体系中高效催化酯交 、酯 蛋白，Flo1p 包含有分泌信号区(secretion signal 合成等反应，其固定化技术得到广泛研究[2-6] 固 domain) 、絮凝功能区(flocculation functional domain) 、 定化RML，如Lipozyme IM-20 ，已经成为商品酶， GPI 锚定 着信号(GPI-anchor attachment signal)及 但高成本仍然是RML 应用于大规模生产的主要 膜锚定区(membrane-anchoring domain) ，其中絮凝 瓶颈 功能区接近N 端，能够识别并且以非 价键连接 [8, 14] 展示酶(displaying enzyme) 是指利用酵母细胞 到细胞壁的甘露聚糖复合物上 ，因而将外源蛋 表面展示技术(yeast surface display) ，使酶蛋白与酵 白的N 端与Flo1p 的絮凝功能区融合，外源蛋白 [8] 母细胞壁蛋白融合，以天然构象的形式锚定在细胞 可以C 端游离的形式展示在酵母细胞表面 ，如