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绿色木霉外源基因表达系统构建 　　摘要：利用PCR方法克隆瑞氏木霉（Trichoderma reesei）外切葡聚糖纤维二糖水解酶Ⅰ基因（cbhⅠ）启动子序列，以pSK载体为骨架，构建了pSK-cbhⅠ-GFP-hph表达载体，并成功转入到绿色木霉（T. viride）Sn-9106中。通过对绿色木霉Sn-9106进行遗传改造，为纤维素酶基因在木霉中同源重组表达提供遗传转化平台。 关键词：绿色木霉（Trichoderma viride）；cbhⅠ启动子；绿色荧光蛋白；外源基因表达 中图分类号：Q786；Q939.5 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2013）13-3180-03 纤维素酶在木质纤维素资源化利用过程中发挥着重要的作用。目前纤维素酶存在酶活性低、对天然木质纤维素分解能力弱、生产周期长以及价格昂贵等问题，严重制约了其工业化应用[1，2]。本实验室选育的绿色木霉（Trichoderma viride）Sn-9106能以秸秆、纸浆等工业废物为碳源，将其中的纤维素转化为可发酵的糖成分，是一株适合固体发酵模式的纤维素酶工业生产菌株[3-5]。随着基因工程技术的不断发展，利用分子生物学手段研究丝状真菌纤维素酶系分泌机制、活性及协同作用等逐渐成为目前研究热点[6-8]。研究表明，纤维素酶在大肠杆菌表达系统中容易形成包涵体、酶活性比较低、缺乏糖基化修饰；在酵母中表达又存在着过度糖基化和蛋白折叠等问题，使表达的纤维素酶活性严重丧失[9]。目前木霉为适合真菌类纤维素酶的表达载体之一[10]。瑞氏木霉（Trichoderma reesei）中外切葡聚糖纤维二糖水解酶Ⅰ基因（cbhⅠ）是纤维素酶基础性表达基因之一。在异源表达过程中，cbhⅠ启动子在没有诱导物存在的情况下也能够启动报告基因表达[1]。本研究利用瑞氏木霉cbhⅠ启动子、以绿色荧光蛋白为报告基因、潮霉素为抗性标记构建绿色木霉表达载体，为构建高产纤维素酶基因工程菌奠定了基础。 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 菌株与载体 瑞氏木霉QM9414、绿色木霉Sn-9106、pET30-GFP质粒和pSK质粒载体由沈阳农业大学生物技术学院保存；pSM565质粒由沈阳农业大学生物技术中心提供；感受态细胞E. coli DH5α购自天根生化科技（北京）有限公司；pMD19-T Simple Vector购自宝生物工程（大连）有限公司产品。 1.1.2 试剂 Taq DNA聚合酶、Long Taq DNA聚合酶等PCR试剂，质粒小量提取试剂盒，DNA Marker，潮霉素，IPTG，X-Gal均购自天根生化科技（北京）有限公司；限制性内切酶，T4 DNA连接酶均购自宝生物工程（大连）有限公司；DNA凝胶回收试剂盒购自爱思进生物技术（杭州）有限公司。 1.2 方法 1.2.1 cbhⅠ启动子、GFP基因、hph基因的克隆 根据GenBank NCBI上瑞氏木霉cbhⅠ启动子、GFP基因及hph基因序列设计引物如表1。提取瑞氏木霉基因组DNA[11]，并以基因组DNA为模板，PCR扩增克隆出cbhⅠ启动子。cbhⅠ启动子用二步法进行PCR扩增程序为：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s ，72 ℃ 3 min，5个循环；94 ℃ 30 s，67 ℃ 3 min，30个循环；72 ℃ 10 min，4 ℃保存。分别以pET30-GFP和 pSM565质粒为模板扩增出GFP基因、hph基因。GFP基因PCR扩增程序为：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，42 ℃ 30 s，72 ℃ 3 min，30个循环；72 ℃ 10 min，4 ℃保存。hph基因PCR扩增程序为：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，53 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s，30个循环；72 ℃ 10 min。PCR产物回收后，与pMD 19-T Simple Vector连接，并送宝生物工程（大连）有限公司测序。 1.2.2 cbhⅠ启动子表达载体pSK-cbhⅠ的构建 将pMD 19-T-cbhⅠ用SacⅠ和EcoRⅠ双酶切，然后与经同样酶切的pSK载体连接，得到重组质粒pSK-cbhⅠ，转化E. coli DH5α感受态细胞。在含氨苄青霉素的培养基上随机选取白色转化子，小量提取制备转化子质粒用于酶切鉴定。 1.2.3 表达载体pSK-cbhⅠ-GFP-hph的构建 将pMD 19-T-GFP用EcoRⅠ和KpnⅠ双酶切，与同样双酶切的重组质粒pSK-cbhⅠ连接，得重组质粒后，再以同样的方法将pMD 19-T-hph进行酶切和连接，构建表达载体pSK-cbhⅠ-GFP-hph。 1.2.4 绿色木霉表达载体p