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阿尔茨海默病患者尿液生物标志物检测 　　[摘要] 目的 探寻阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease，AD） 患者尿液中潜在的生物标志物，为AD的早期诊断提供依据。 方法 通过超高效液相色谱-质谱联用和代谢组学的方法，考查AD患者和正常老年人尿液中代谢产物的扰动。对于超高效液相色谱-质谱联用所产生的色谱图，进行主成分分析显示出疾病组和正常组之间的代谢物的变化。 结果 AD患者的鞘氨醇类、色氨酸相对于正常组变化明显，发现7个潜在的与AD相关的生物标志物。 结论 AD患者的代谢物谱发生了明显改变，可以为AD的诊断提供依据。 [关键词] 阿尔茨海默病；代谢组学；生物标志物 [中图分类号] R749.16 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2013）06（b）-0007-03 阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）是一种进行性发展的致死性神经退行性疾病。65岁以上的老年人口中AD的发病率为5%～10%，而80岁以上的老年人口中其发病率高达50%[1]。目前尚不能对AD行早期诊断，更无有效的治疗措施， AD的防治是一项国际性的难题。代谢组学是研究外源性物质对生物体产生的整体效应，并以生物体内物质分子的整体作为对象， 通过核磁共振（NMR）、液相色谱-质谱联用（LC-MS）、气相色谱-质谱联用（GC-MS）等高通量、高分辨、高灵敏度的现代仪器分析手段，定性或定量研究生物体液中的代谢产物，研究药物对机体所形成代谢组的系统作用[2-3]。本研究采用代谢助学的方法，确定AD的潜在生物标志物。 1 材料与方法 1.1 仪器与试剂 液相系统Waters AcquityTM Ultra Performance Liquid Chromatography （UPLC） system，购自美国Waters公司；质谱仪Micromass Quattro microTM API三重四级杆质谱仪，购自美国Waters 公司；高效液相-飞行时间质谱联用仪（HPLC-ESI-QTOF- MS），购自德国Bruker公司；台式离心机（TGL-16C），购自海安亭科学仪器厂；高速台式冷冻离心机（TGL-16），购自湘仪离心机仪器有限公司；振荡器CAY-1型液体快速混合器，购自 北京长安仪器厂；微量取样器（200 μL）Proline单道可调移液器，购自上海科华实验系统有限公司；乙腈（色谱纯）、甲醇（色谱纯），购自美国 Fisher公司。 1.2 实验对象 本研究选取中国医科大学附属盛京医院AD患者（阿尔茨海默病组）和健康的老年志愿者（对照组），各20例，两组一般情况比较，差异无统计学意义（P 0.05）。见表1。本研究遵照《赫尔辛基宣言》的原则实施。健康老年受试者没有神经和认知疾病。 1.3 实验方法 1.3.1 尿样采集与预处理 采集20例AD患者和20例健康老年志愿者晨尿，约10 mL，加叠氮化钠作为防腐剂，3500 r/min离心10 min。取上清液至于-20 ℃的冰箱中，待用。 1.3.2 图谱采集 取200 μL尿样加入1.5 mL EP管中，加入400 μL甲醇沉淀蛋白，在4 ℃的低温离心机中，15 000 r/min离心10 min，上清液转移至另一EP管中，保持30℃恒温，在N2气流下吹干，用100 μL甲醇复溶，复溶后转移至2 mL的进样瓶中，进样10 μL，用于UPLC-MS分析。 1.3.3 数据分析 通过Masslynx software （version 4.0）系统中的Markerlynx软件进行原始数据的分析，包括峰检测和校准，测定每个峰的保留时间和质荷比（m/z）数。由这些数据得到每个色谱图上的总离子强度数据。运用Markerlynx软件进行主成分分析，主要参数设置如下：质谱的质量数误差为0.01 Da，噪音消除水平为10.0，初始和结束保留时间为别为0和 16 min，低、高分子量分别设置成100、1000 amu。 1.3.4 生物标志物的鉴定 从全扫描质谱图中分析生物标志物并且作图。由碰撞诱导的裂解（CID）方式可以得到这些潜在生物标志物的裂解谱图。一些标志物与标准物质对比色谱峰保留时间和二级质谱碎片特征。这些代谢物的全扫描质谱图，通过查找可利用的生物化学数据库，例如KEGG、METLIN等得到解释。同时，一些生物标志物通过在相同液相条件下，对比在Bruker飞行时间质谱（ESI-QTOF-MS）上的保留时间和精确分子量来确认。 2 结果 2.1 UPLC/MS代谢产物的图谱 阿尔茨海默病组和对照组尿样总离子流（TIC）色谱图。见图1。 2.2 UPLC/MS数据分析