瘦素对于孤雌激活PA和转基因体细胞细胞核转移SCNT导出的猪胚胎发育各阶段的促进辅助作用.docVIP

瘦素对于孤雌激活PA和体细胞细胞核转移SCNT 导出的猪胚胎发育各阶段的辅助促进作用 Heng-xi WEI,Kun ZHANG,Yu-fang MA,Yan LI,Qiu-yan LI,Yun-ping DAI and Ning LI 摘要：数据表明，瘦素在胚胎植入前的胚胎发育过程中扮演重要角色，但仍然存在着争议并且很少人了解瘦素是否有一个对于猪胚胎发育个阶段的辅助控制作用。实验的目标是为了调查在体外培养中加入瘦素中间物对于由PA和SCNT导出的猪胚胎发育的影响。我们发现加入50ng/ml重组瘦素提高了PA胚胎达到囊胚阶段的速度并且和对照组相比增加了囊胚阶段所有细胞的数目。在瘦素加至50ng/ml 时SCNT胚胎达到囊胚的最大速度，同时囊胚细胞数目在瘦素达到500ng/ml有可观的增长速度。然而，在任意实验组中，内细胞团数目占到所有细胞的比率不受瘦素作用。从第三天开始补充50ng/ml瘦素，大概在第4~8个细胞发育阶段，与不控制相比，孤雌激活胚胎发育成囊胚的速度明显的增加并且抑制细胞凋亡。当在第一天到第三天或第四天到第六天加入瘦素（50ng/ml）到培养基，对于胚胎发育没有有效的作用。这些结果表明瘦素能够促进发育和提高孤雌激活胚胎和细胞核转移的胚胎的质量；同时50ng/ml瘦素能够完成对处于4~8细胞阶段胚胎的基本刺激作用，瘦素对于猪的孤雌激活和细胞核转移的胚胎的受精卵转变没有作用。 关键词：胚胎发育，瘦素，孤雌激活，猪，体细胞核转移 瘦素对于猪无精生殖和克隆胚胎的作用 体细胞核转移克隆的猪和其他多种哺乳动物的生产不仅有力地表明分化的体细胞仍然保持完整的基因信息，因此能够再分化和去分化，而且同时提供了一种研究胚胎干细胞、转基因、基因打靶和这些物种的人造可复制技术的革命性的方法。虽然体细胞核转移在农业，医药和基础研究中有重要意义，但由于低效率，广泛应用的体细胞核转移技术被限制。但相信它的低效率是重新编码的时错误所造成，特别是未完成的后来的重新编码，能通过供应准备、卵母细胞成熟，激活和胚胎培养体系的修改，使其某几个区段。研究表明改变氧含量、基本培养基或补充某几种生长因子，细胞因子，维他命或者氨基酸能够增强胚胎植入前的发育或者克隆胚胎的质量。瘦素，一种16KD可复制激素由肥胖基因产生，在许多的器官包括可再生部位合成，对于繁殖有一个显著直接的作用。研究证明瘦素有益于牛和猪的卵母细胞体外成熟通过STAT3和MAPK途径，据此许多的研究小组已经试图去测试是否瘦素的补充可以提高早期哺乳动物胚胎的发育。1000ng/ml浓度的瘦素能够显著的增加猪体细胞核转移胚胎的囊胚化速度，但这种作用没有在猪的体外胚胎培养中发挥。然而，瘦素10ng/ml浓度能够显著地增加猪的孤雌激活胚胎卵裂和生成囊胚的速度。老鼠胚胎中，Kawamura已经证明瘦素能够显著地促进老鼠扩张囊胚和孵化囊胚的发育，同时Swain证明瘦素浓度的增加对于单细胞胚胎发育没有作用；Fedorcsak和Storeng已经证明甚至低浓度的瘦素能够减少DNA碎片和抑制胚胎发育至囊胚阶段。基于以上的研究报告，我们已经了解瘦素对于猪和老鼠胚胎早期发育的作用仍然存在着争议。因此进一步的研究被要求确定查明瘦素的作用，特别是瘦素对于猪胚胎体外培养发育的作用是否是一种分阶段的辅助调控类型。 现在的研究我们旨在调查瘦素剂量不同，使得其对于从SCNT和PA导出的体外培养的猪胚胎发育和质量的影响，探索瘦素对于猪胚胎体外培养发育的作用是否是一种分阶段的辅助调控类型。 材料和方法 化学药品 除了其他申明，所有的化学药品从Sigma-Aldrich购买。 卵母细胞的收集和体外培养 在屠宰室收集发情母猪卵巢，放于添加抗生素的30~35℃生理盐水在3hour内运送到实验室。从3~6mm直径的卵泡发育而来的卵丘卵母细胞复合体COCs被连在10ml自由使用注射器的18规格细针吸取。将至少有三层细胞堆积的COCs筛选，在补充10%猪卵泡液、0.57mM半胱氨酸、0.1mM的EDTA-Na、2mM的Na-丙酮酸盐、1mM的L-谷氨酸盐、10ng/ml表皮生长因子、10IU/ml孕马血清促性腺激素和10IU/ml人绒毛膜促性腺激素的组织培养液中培养。pFF被从5-8mm直径的卵泡中吸出，在1600r/min转速下转30min，收集上层清液，通过0.45um注射过滤器过滤并储存至-20℃直到使用。所有的体外成熟培养的培养基在体外成熟培养前必须在CO2细菌培养器中缓冲2h。50-60的COCs在450um的底部覆盖着400ul矿物油的培养基中在39℃和100%湿度，空气含5%CO2培养42-44h。 猪转基因供细胞的准备 无菌条件下获取日龄30d的长白猪的胚。在去掉胎的头部和内脏后，体组织在DPBS中冲洗两次，且切成小片。小片被植