辽宁新品系绒山羊12个基因功能的分析.docVIP

辽宁新品系绒山羊CUX1等11个基因功能的分析 摘要：为了对辽宁新品系绒山羊CUX1等基因的生物学功能进行分析。利用SMART技术构建了辽宁新品系绒山羊皮肤组织cDNA文库，首先利用Trizol Reagent提取皮肤总RNA,然后用Oligotex分离mRNA，再以mRNA为模版，在逆转录酶的作用下合成cDNA第一条链，然后利用LD-PCR扩增技术获得cDNA的第二链，对cDNA的末端进行处理后，分级分离，与载体相连接，感染宿主细胞。经测序得到EST序列，通过对序列测定和生物信息学初步分析，用Blast X及B last N软件进行同源比对。本文从中选取11条EST序列查阅相关资料确定这些基因的功能了功能上的分类如下：参与细胞生长代谢的基因4个；与疾病相关基因5个；未分类2个。 辽宁新品系绒山羊；SMART；cDNA文库1.引言 绒山羊分布在很多国家，有68个品种和类型，我国有23个山羊品种列入品种志。其中辽宁绒山羊是目前世界上绒毛品质优良、绒量最高的白绒山羊品种，以其产绒多，绒纤维长，含绒率高、细度好而著称。又因其遗传性稳定，杂交改良低产山羊效果显著而而被誉为“中华国宝”。2000年品种鉴定时有羊近100万只，到2004年已发展到140多万只。 辽宁山羊是我国绒山羊品种中产量最高的优良品种，主要位于辽东半岛的盖县，岫岩，风城，宽甸，瓦房店及辽阳7县。辽宁绒山羊具有很高的遗传性能，近年来，新疆，陕西，河北，山西，甘肃，内蒙古等省区引用辽宁绒山羊改良本地山羊，对提高绒产量有明显的效果。 羊绒是绒山羊的内层毛被，是由次级毛囊产生[4]，它具有轻柔、光滑，细软等特点，是天然纤维中的珍品，被称为“纤维之王”[5]。绒山羊羊绒的品质如细度、净绒率、光泽度、柔软度、拉直强度等重要经济性状与毛囊兴盛期皮肤基因的表达有关[6]。 1.1 构建cDNA文库的意义 自20世纪70年代中期，首例cDNA克隆问世以来，构建cDNA文库已经成为研究成功基因组学的基本手段之一。cDNA便于克隆和大量表达，它不像基因组含有内含子而难于表达，因此可以从cDNA文库中筛选到所需要的目的基因，并直接用于该基因的表达。通过构建cDNA文库不仅可以保护濒危珍惜的生物资源，而且可以提供构建分子标记连锁图谱所用的探针，更重要的是可以分离基因全长而展开对全部基因的研究。因此，自从1976年成功的构建了第一个cDNA文库以来，cDNA文库就受到越来越多的重视并被运用到基因的研究中。 2.材料2.1 材料 2.1.1取材 选取1只成年辽宁新品系雄性绒山羊，用剪刀剪去背部一处的绒和毛，首先用碘酒消毒，然后再用70%的酒精脱碘后，用灭菌的镊子夹住所需要的背部组织的两侧,迅速用消毒的刀片取背部皮样5mm3，然后放入70%酒精中浸泡30s，再用含有250U/mL青霉素和250μg/mL链霉素的无菌生理盐水（DPBS）冲洗3遍，将提取生物组织块放入灭菌的盛有DPBS的小瓶中，用封口膜封口，再放入4℃保温瓶带回实验室[9]，转至冻存管中，加入DSMO保护液，封口膜封口，按下列顺序降温：室温→4 ℃ （10 分钟）→ -20 ℃ （30 分钟） → -80 ℃ （16 - 18 小时或隔夜) →液氮槽vapor phase 中长期储存备用[10]。 2. 药品 Trizol Reagent总RNA分离试剂盒购自GIBCO/BRL公司，Oligotex mRNA Minikit纯化试剂盒购自QLAGEN公司，STMARTMcDNA文库构建试剂盒购自clontech公司，宿主菌选取E.coli DH5α。[11] 2.3 引物 合成cDNA所需引物可按照试剂盒的要求合成，SMART（switching mechanism at 5‵end of RNA transcript）Ⅲ寡核苷酸： 5‵-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTGGCCATTACGGCCGGG-3‵； CDSⅢ/3‵PCR 引物： 5‵-ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATG –d(T) 30N-1N-3‵； 5‵PCR 引物： 5‵-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3‵； M13(Forword-47)通用测序引物是由赛百盛公司合成。 实验方法 目的组织细胞新鲜的样本 总RNA的提取 Oligo纤维素凝胶纯化 5’ AAAAAA3’mRNA Oligo Dt引物 5’ AAAAAA3’ mRNA TTTTTT Oligo Dt 反转录酶dNTPs AAAAAA mRNA