PCR和DNA测序2011.ppt

PCR和DNA测序技术;Polymerase Chain Reaction (PCR，多聚酶链式反应) 特异片断的体外扩增技术 无细胞克隆技术 (“free bacteria” cloning technique）;常用PCR仪;1993年至今： 计算机技术使循环操作实现了程序化和自动化，简化了PCR操作程序，使之迅速得到推广。 PCR技术是方法学上的一次革命，生物学及医学领域的 一个里程碑，巨大的推动作用。;类似DNA在细胞内的复制过程: 由一对引物介导,通过温度调节，使双链DNA变成单链（变性）； 单链DNA能与引物复性（退火）成为 引物-DNA单链复合物； 在dNTPs存在下，DNA聚合酶能使引物沿单链模板延伸成为双链DNA（延伸） PCR循环：一个热变性-复性-延伸的过程。 通常，20-30个循环之后，可获得大约106倍待扩增的DNA片段的拷贝。;DNA在细胞内的复制过程a;DNA在细胞内的复制过程b;DNA复制过程中,2条新生链都只能从5端向3端延伸,前导链连续合成,滞后链分段合成.;DNA在细胞内的复制过程d;DNA在细胞内的复制过程e;1.PCR的基本原理;PCR的第1个循环过程;PCR的第1和2个循环过程;PCR;PCR技术的使用;1)DNA模板的解链（变性） 90 ℃~95 ℃，30s 理论上，在90℃左右能使DNA双链之间的所有氢键链断开，完全分离为单链； 且在中性pH情况下，DNA的完整性仍能很好保存;2)DNA 单链与引物的退火（复性） 55 ℃~65 ℃ ，30~45s 引物与模板单链特异性结合（较高的温度）； 不希望两条互补的模板单链结合在一起（DNA引物的量大大超过模板的量，竞争性结合：引物+模板几率DNA自身复性 几率 ）; 引物的最佳退火温度Tm-5 ℃，引物的量 引物的长度;3)引物的延伸（新链DNA的合成） 70℃~75 ℃，30~60s （2kb) 首次循环：引物从3’端开始延伸，延伸片段的5’端为人工合成引物是特定的， 3’端没有固定的终止点，长短不一 第二个循环：引物与新链结合，由于后者5’端序列是固定的末端，意味着5’端的序列就成为此次延伸片段3’端的终止点 N个循环后：由于多数扩增产物受到所加引物5’端的限定，产物的序列是介于两种引物5’端之间的区域 引物本身也是新生DNA链的一部分 (10kb----15min);4)循环次数的设定 主要取决于最初靶分子的浓度 如：3x105、1.5x104、1x103、 50 copy 25~30、 30~35、 35~40、40~45cycle 过多的循环次数会增加非特异性扩增和碱基错配数； 平台效应：PCR反应后期，扩增产物并不成指数方式的增加； 产生原因：dNTP与引物浓度降低，酶对模板的比例相对降低，酶活力降低，产物浓度增高后变性不完全而影响引物延伸;温度（℃）;2.标准体系：常选用20~100ul体系 模板核酸（template如：人基因组DNA 0.1ug) 扩增引物（primer一对,各0.25umol/L） TaqDNA聚合酶（2.5U） dNTP（四种：各200umol/L) 标准缓冲液：10X buffer（KCl、Tris-HCl、MgCl2、BSA或明胶） 无菌双蒸水或三蒸水 石蜡油或矿物油:30-50ul（封闭、防止高温时液体的挥发）;3. 影响PCR反应的因素 ( 最适条件）;a.引物的作用：定位、定向、定范围，引物决定PCR扩增产物的特异性与长度，引物设计决定PCR反应的成败。;9)引物的5’端可以修饰：包括加酶切位点，用生物素、荧光物质、地高辛等标记，引入启动子序列，引入蛋白质结合DNA序列等。;c.引物的浓度： 0.1-0.5umol/L；引物：模板=108：1。 过低：将导致扩增效率下降； 过高：导致异位引导而使扩增的特异性下降。 对称PCR：二个引物的浓度相等； 不对称PCR：二个引物的浓度为50:1或100:1;(3)DNA聚合酶;Characteristics of Taq Polymerase ;Tth、Pfu、Vent聚合酶：具有校读功能。 因为具有3’-5’外切酶活性，高保真扩增。活力要比Taq酶低。;总结;常用的PCR技术;1、热启动P