一种改进的窖泥微生物总dna提取方法.pdfVIP

投稿信箱：zwspzz1994@163.com Food Forum 食品论坛 一种改进的窖泥微生物总DNA提取方法 1 2 1 彭昱雯 吴冬梅 李 丹 （1.四川大学锦江学院白酒学院，四川 彭山 620860；2.泸州职业技术学院白酒学院，四川 泸州 646005） 【摘 要】本文以某酒厂不同生产工艺的两种窖泥为例，利用铝离子与腐植酸发生絮凝的反应，采用Al (SO4) 溶液对窖泥样品进行前 2 3 处理，从而去除窖泥DNA提取的主要干扰物质腐植酸，然后采用SDS破壁释放窖泥微生物中的DNA。该方法能较大程度的获得窖泥微 生物的真实面貌，所提DNA完全适用于后续PCR扩增以及一系列的分子生物学研究。 【关键词】腐植酸；窖泥；DNA提取；Al (SO4) 2 3 1.引言 号、079号窖池。窖泥采集后置于保鲜袋中，封口，-20℃ 窖池是浓香型白酒酿造过程中重要的固态生物反应器。 保存备用。 不间断的生产过程使窖池内窖泥微生物长期处于高酸度、高 2.2 窖泥样品的前处理 乙醇和微氧的环境中，赋予了其微生物群落结构的多样性和 称取5g窖泥于离心管中，5个样。分别加入20mlPBS溶 特殊性。窖泥微生物群落结构对产品风格和质量的影响已引 液（pH8.0）、2g玻珠，涡旋震荡。分别加入0ml、1ml、 起众多研究者的高度关注。探讨窖泥微生物群落结构对浓香 2ml、3ml、4ml Al (SO4)溶液（0.1M），并各自加入4ml、 2 3 型白酒的生产与风味的改良具有指导性意义。 3ml、2ml、1ml、0mlPBS溶液（pH8.0）补足体积。充分的 在窖泥微生物生态学的免培养法研究中，获得高浓度、 涡旋振荡，800r/min下离心10min，取上清液，并将其至一 大片段、多样性程度高的窖泥微生物总DNA已成为了一个迫切 干净离心管中，10000r/min离心5min，去除上清液，将沉 的需求。然而，窖泥中较高的腐植酸含量是一个不容忽视的问 淀转移至1.5ml离心管中，立即进行窖泥总DNA的提取。 题，腐植酸的干扰不仅阻碍窖泥总DNA的提取，并且影响后续 2.3 微生物DNA的提取步骤 的PCR扩增以及一系列酶切反应。由于腐植酸与DNA具有相似的 （1）使上步骤中的沉淀溶解于500μl DNA提取液 分子结构[3]，去除腐植酸的同时而不影响DNA的得率一直是尚 （0.1M Tris-HCl,0.1M EDTA,1.5M NaCl,1%CTAB,pH8.0） 待解决的难题[4-6,9,10,12,13]。在现有的窖泥微生物分子生物学研 中，加入10μl溶菌酶（50mg/ml）,37℃水浴摇床1h。 究中，对其总DNA的提取多采用商用的土壤DNA提取试剂盒[15] （2）加20%SDS 10μl，65℃保温1.5h。 或传统的氯仿酚法直接提取，并未针对窖泥性质的特殊性， （3）加10μl蛋白酶K（5m