掌握革兰氏染色方法.PPTVIP

实验三普通光学显微镜的使用及革兰氏染色方法庞昕 一、实验目的及要求 复习显微镜低倍镜和高倍镜的使用技术，了解油镜的基本原理，掌握油镜的使用方法。 学习微生物制片、染色的基本技术，掌握革兰氏染色方法。 初步认识细菌的形态特征。 了解细菌的革兰氏染色原理及其在细菌分类鉴定中的重要意义。 二、实验原理 1.显微镜的构造 光学部分:目镜 、 物镜 、 照明装置（聚光镜、 虹彩光圈、 反光镜等）。它使检视物放大,生成物像。 二、实验原理 机械部分: 镜座、镜臂、镜筒、物镜转换器、载物台、载物台转移器、粗调节器、细调节器等部件。它起着支持、调节和固定等作用。 2.油镜头的辨认： 油镜头有OI(oil immersion)或HI（homogeneneous immersion）字样，其放大倍数和数值孔径最大，而工作距离最短。 3.油镜使用的原理：当光线由反光镜通过玻片与镜头之间的空气时，由于空气与玻片的密度不同，使光线受到曲折，发生散射，降低了视野的照明度。若中间的介质是一层油（其折射率与玻片的相近），则几乎不发生折射，增加了视野的进光量，从而使物象更加清晰。 二、实验原理 显微镜的放大倍数和分辨率 1. 放大倍数：物镜放大倍数×目镜放大倍数 2. 显微镜的分辨率:是表示显微镜辨析两点之间距离的能力。可用公式表示为： D=λ/2n·sin(α/2 ) 式中D：物镜分辨出物体两点间的最短距离。 ?：可见光的波长（平均0.55?m) n: 物镜和被检标本间介质的折射率。 ?：镜口角（即入射角）。 D值越小，分辨率越高，看到的物象越清晰 二、实验原理 显微镜保养和使用中的注意事项: 1.不准擅自拆卸显微镜的任何部件,以免损坏。 2.镜面只能用擦镜纸擦，不能用手指或粗布，以保证光洁度 3.观察标本时，必须依次用低、中、高倍镜，最后用油镜。当目视接目镜时，特别在使用油镜时，切不可使用粗调节器，以免压碎玻片或损伤镜面。 4.拿显微镜时，一定要右手拿镜臂，左手托镜座，不可单手拿，更不可倾斜拿。 5.显微镜应存放在阴凉干燥处，以免镜片滋生霉菌而腐蚀镜片。 二、实验原理 二、实验原理 简单染色法是利用单一染料使细菌着色以显示其形态的染色方法。常用于染色的染料主要有碱性染料、酸性染料和中性染料三大类。 碱性染料电离时，其分子染色部分带正电荷，能和带负电荷的物质结合。由于细菌生长于中性、碱性或弱酸性的溶液中时常带负电荷，所以通常采用碱性染料使其着色。 当细菌分解糖类产酸使培养基pH下降时，细菌所带正电荷增加，因此易被伊红、酸性复红或刚果红等酸性染料着色。中性染料是前两者的结合物又称复合染料，如伊红美蓝、伊红天青等。 革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家C.Gram创立的。作为细菌学上最常用最重要的鉴别染色法，革兰氏染色法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌（G+）和革兰氏阴性菌（G－）两大类。 G－菌的细胞壁中含有较多易被乙醇溶解的类脂质，而且肽聚糖层较薄、交联度低，故用乙醇或丙酮脱色时溶解了类脂质，增加了细胞壁的通透性，使初染的结晶紫和碘的复合物易于渗出，结果细菌就被脱色，再经番红复染后就成红色。 G+菌细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高，类脂质含量少，经脱色剂处理后反而使肽聚糖层的孔径缩小，通透性降低，因此细菌仍保留初染时的颜色。 二、实验原理 二、实验原理 细菌细胞壁的结构 三、实验器材 1、菌种：枯草杆菌（Bacillus subtilis）， 大肠杆菌（Escherichia coli）， 金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus） 2、染色液和试剂：吕氏碱性美兰染液、结晶紫、碘液、95%乙醇、番红、二甲苯、香柏油 3、器材：显微镜、洗瓶、载玻片、接种环、酒精灯、擦镜纸、废液缸 四、实验方法 1、简单染色： （1）涂片：注意取菌不要太多。 （2）晾干：自然晾干。 （3）固定