hTERT启动子调控的PUMA重组腺病毒的构建与鉴定.pdfVIP

443O 重庆 医学2013年 l2月第 42卷第 36期 · 基础研究 · hTERT启动子调控的PUMA重组腺病毒的构建与鉴定 王 冬，周 琦△，李雨聪 (重庆市肿瘤研究所妇瘤科 ，重庆 400030) 摘 要 ：目的 构建人端粒酶逆转录酶(hTERT)启动子调控的PUMA基 因腺病毒载体(Ad—hTERrr_PuMA)及带有增强型 绿色荧光蛋 白(EGFP)基 因的腺病毒载体 (Ad—hTERT—PUMA-EGFP)。方法 采用一系列的分子生物学技术将 p53正向凋亡调 控 因子 PUMA基 因插入 hTERT 的启动子下游 ，再将 EGFP为分子标记插入到PUMA基 因下游，最终将构建好 的载体装入腺病 毒 。双酶切实验证明重组腺病毒载体 Ad—hTERT—PUMA和 Ad—hTERT-PUMA—EGFP构建是否成功。结果 载体均成功转配 腺病毒 。转染 12h后 ，部分 HEK293细胞 出现 了绿色荧光 ，可维持到 72h。结论 成功构建重组腺病毒载体 Ad-hTERT—PUMA 和 Ad—hTERT—PUMA—EGFP。 关键词 ：端粒 ，末端转移酶 ；p53正向凋亡调控 因子；遗传学 ；腺病科 doi：10．3969／j．issn．167l一8348．2013．36．026 文献标识码 ：A 文章编号 2013)36—4430—03 Constructionandverification ofadenoviruscontainingthePUMA geneunderthecontrolofthehTER promoter WangDong，ZhouQi ，LiYucong (DepartmentofGynecologicalOncology，ChongqingCancerInstitue，Chongqing400030，China) Abstract：Objective ToeonstruttheadenovirusvectorsofAd—hTERT—PUMA—EGFPcontaininghumantelomerasereverse transcriptase(hTERT)，PUMA andenhancedgreenfluorescentprotein (EGFP)．Methods Byaseriesofmolecularbiologytech— niques，PUMA genewasinsertedintodownstream ofthehTERT promoter．AndthenEGFPwasinsertedintodownstream ofthe PUMA inadenovirusvectors．Finally，recombinantadenovirusvector，Ad—hTERT—PUMA-EGFP wasassembledintotheadenovi— rus．Results CorrectadenoviruslaodingvectorswasverifiedbyviralgenomePCR technology．After12hoftransfection，HEK293 cellsshowedgreenfluorescencein72h．Conclusion ThecorrectstructureoftheadenovirusvectorscontainingPUMA geneand EGFP genewasidentifiedbyrestrictionenzymeanalysis． Keywords：telomeraseterminaltransferase；p53up—regulatemodulatorofapoptosis；genetics；adenoviridae 腺病毒可有效感染并裂解部分肿瘤细胞 ，且在正常细胞 内 子下游存在多克隆位点，人 PUMA基 因(NM 014417)购 自长 不能复制 ，所以具有较好 的安全性 ，可应用于肿瘤基 因治疗。 沙赢润生物技术有限公司，装载载体为 pUC57。绿色荧光蛋 已证实，端粒酶在 85