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小鼠骨髓染色体制备及观察 1、实验目的与要求 了解小鼠骨髓染色体畸变的意义； 掌握小鼠骨髓细胞染色体标本的制备方法 观察小鼠染色体的形态特征和染色体数目 许多化学毒物具有遗传毒性 基因突变：碱基置换和移码突变。 染色体畸变（structural chromosome aberration)： 是指由于染色体或染色单体断裂，造成染色体或染 色单体缺失或引起各种重排，从而出现染色体结构 异常 颜色体数目异常：整倍性和非整倍性改变。 染色体损伤的类型：  染色体数目的改变 ① 非整倍体：亚二倍体或超二倍体。 ② 整倍性改变：染色体成倍增加。  染色体结构的改变 1. 断裂和裂隙： 2. 微小体；较断片小而呈圆形。 3. 有着丝点环：带有着丝点部分，两端形成环状结构并伴有一双无着丝 点断片。 4. 无着丝点环：成环状结构。 5. 插入/重复 8 非特定性型变化：如粉碎化、着丝点细长化、粘着等 变 畸 性 倍 整 变 畸 性 倍 整 非 如何评价化合物的遗传毒性？ 鼠伤寒沙门氏菌回复突变试验（Ames试验）：是最 常用的检查基因突变的方法。检测受试物诱发鼠伤寒 沙门氏菌组氨酸营养缺陷型突变株(his-) 回复突变成野 生型(his+)的能力 评价染色体损伤的试验方法包括： 常用啮齿类动物骨髓嗜多染红细胞(PCE) 微核试验 体外培养细胞或者体内染色体畸变试验 2、实验原理 有丝分裂：真核细胞的染色质凝集成染色体，复制的 姐妹染色单体在纺锤丝的牵拉下分向细胞的两极，从而 产生两个染色体数目和遗传性相同的子细胞的一种细胞 分裂的类型。 细胞周期：从一次有丝分裂完成时开始，到下一次有 丝分裂结束时为止，成为一个细胞周期。 间期： G1期，DNA合成前期； S期，DNA合成期；DNA经过复制，含量增加一倍，细胞成为4倍体。 G2期，DNA合成后期。 分裂期： 前期：染色质浓缩形成染色体；中心体向细胞两极移动，纺锤体出现。 中期：核膜核仁消失，染色体排列于细胞的赤道平面上，从纺锤体发出 微管附着于染色体的着丝粒上。 后期：姐妹染色单体分离 末期：染色体解螺旋，重新出现核膜核仁，细胞一分为二 G1 ：从有丝分裂结束到DNA复制之前； S: DNA合成； G2 ：DNA复制结束到有丝分裂开始； M ：有丝分裂期 增殖群细胞，细 胞始终保持分裂能 力，持续进入分裂 循环； 不再增殖细胞， 比如神经细胞； 暂不增殖细胞， 比如肝脏细胞。 秋水仙素，又称秋水仙碱，能与微管蛋白二聚体结 合，破坏纺锤体的形成，使染色体停滞在分裂中期。 本实验所用的小鼠骨髓细胞具有高度的分裂活性并 且数量非常多,经秋水仙素处理后,可使分裂的细胞 阻断在有丝分裂中期,再经低渗、固定、滴片染色 等处理,便可制作较好的小鼠骨髓细胞染色体标本。 3、实验材料  实验动物：健康雄性昆明种小鼠  试剂 • 0.1 ％秋水仙素：称10 mg秋水仙素，溶于10 mL生理盐水中。 • 0.075M的KCl低渗溶液：称5.59克KCl溶于1,000 mL蒸馏水中。 • 2.2%柠檬酸钠溶液：称取22g柠檬酸钠溶解于1000ml蒸馏水中。  实验器材  恒温培养箱、普通离心机、显微镜、分析天平、架盘天平、  离心管(5～10 mL)、吸管注射器(5 mL)、100 mL烧杯、  载玻片 4、实验步骤 ① 秋水仙素(4 mg/kg bw)腹腔注射 ② 脱臼处死小鼠，分离股骨，去附着肌肉，剪去两端骨骺，用5ml注射 器吸取4ml柠檬酸钠溶液将骨髓冲入10 ml离心管中；反复冲洗，直至 股断面由红色变为白色。 ③ 低渗，1500 rpm ×10min，弃上清，加入4mL0.075M 的KCl，37 ℃放 置20min 。 ④ 固定，1000 rpm ×10min，沉淀中加入甲醇/冰醋酸(3:1)固定 20min;1500 rpm ×10min，沉淀中加入甲醇/冰醋酸(1:1)固定20min ； ⑤ 1000 rpm离心10min，留取上清液，用吸管混匀制备细胞悬浮液； ⑥ 滴片。将洗净的载玻片从冰水中取出，立即吸取细胞悬液在玻片的1/3 处滴2-3滴，轻吹细胞悬液扩