遗传转化 农杆菌Z课件.pptVIP

T-DNA区：转移DNA，农杆菌侵染细胞时， 从Ti质 粒上切割下来转移到植物 细胞上的一段DNA Vir区：毒性区，激活T-DNA转移。 Con区：接合转移编码区，该区存在着与细菌间接 合转移的有关基因（tra），调控Ti质粒在 农杆菌之间的转移。 Ori区：复制起始区 染色体上的一些其他遗传座位 这些基因在致瘤过程中具有决定农杆菌细胞表面特性和调控Ti质粒Vir基因的表达的作用。 土壤农杆菌介导转化 主要步骤： (1)细菌在植物敏感细胞上吸附； (2 )农杆菌中Ti质粒上的Vir区基因被激活； 损伤细胞分泌物→Vir自身磷酸化→ VirG(转录因子) (3)T-DNA切割和T-DNA复合物形成； virD基因产物对T-DNA进行剪切 virE2蛋白分子（为DNA单链结合蛋白）相结合，形成T链复合物（T-complex）。 (4)T-DNA复合物由农杆菌进入植物细胞； T链复合物在virD2和virE2核定位信号（NLS）引导下以virD2为先导被转运入细胞核 (5)T-DNA整合到植物染色体上并且进行表达。 ? * 实验八 植物的遗传转化 ? 主要方法有： DNA直接导入基因转化 1 化学诱导DNA直接转化 2 物理法诱导DNA直接转化 种质系统介导基因转化 1 花粉管通道法介导基因转化 2 生殖细胞浸泡法介导基因转化 3 胚囊、子房注射法介导基因转化 生物介导的基因转化 1 植物病毒介导的基因转化 2 农杆菌介导的基因转化 优点: 操作简单，不需要特殊的仪器，获得转基因植株 周期短，转化效率高等 农杆菌介导的基因转移 1? 农杆菌简介 ? 革兰氏阴性土壤杆菌。 根癌农杆菌 (Agrobacteriumtumefaciens): Ti质粒 ,能诱导被侵染的植物细胞形成肿瘤 ,即诱发冠瘿瘤 ; 发根农杆菌 (Agrobacteriumrhizogenes): Ri质粒 ,能够诱导被侵染的植物细胞产生毛发状根。 根癌农杆菌属于根瘤菌科,农杆菌属,革兰氏阴性菌。好氧，最适生长温度为25-30℃，最佳生长pH为6.0-9.0，研究表明，双子叶植物中有93属643种对农杆菌敏感，而单子叶植物则普遍不敏感。 2.根癌农杆菌致瘤的机制 根癌农杆菌Ti的致瘤过程需要如下条件： 植物的损伤信号及环境因子。 菌体的识别和附着位点。 Ti质粒的必需组成元件，包括T－DNA区域和 致毒基因(Vir gene)。 位于根癌农杆菌染色体上的一些其他遗传座位 植物损伤信号及环境因子 植物损伤信号（糖类和酚类化合物）可指导农杆菌对植物细胞的趋化性移动，并可诱导农杆菌Vir基因的表达。 化学诱导信号中最强的为酚类化合物，包括儿茶酚、没食子酸、香草醛，乙酰丁香酮等, 以乙酰丁香酮的诱导效果最佳。 。 菌体识别和附着位点 在植物细胞壁上存在着由碳水化合物、蛋白质和果胶组成的农杆菌附着的受体位点，位于完整细胞的表面。在农杆菌细胞壁上也存在着吸附到植物细胞壁的结合位点，由位于细菌外膜的蛋白质和脂多糖构成。农杆菌附着到植物细胞上后，分泌出果胶酶等物质，消化植物细胞壁，从而形成农杆菌侵入植物细胞的通道。 Ti质粒的必需组成元件 1. 农杆菌的培养 培养基： LB, YEM, YEB 生长周期: 固体培养1-2天，液体培养2-3天。 农杆菌接种后，一般需要在25-30 ℃的条件下，1-2小时才开始分裂。因此当用抗生素筛选菌株时，需要在液体培养液中2小时后再加入抗生素，以便让抗性基因充分表达。 2．Vir区基因活化诱导物的使用 乙酰丁香酮(AS) ，羟 基乙酰丁香酮(OH-AS) 使用方法： 1, 在农杆菌培养液中加入AS。 2, 共培养基中加入。 3，在农杆菌培养液中和共培养基都加入AS。 使用的pH值： 5.0-5.6, Vir区基因的诱导达到最高水平。 3．外植体的选择 转化只发生在细胞分裂的一个较短的时期 细胞分裂周期