医疗机构污水和污泥中粪大肠菌群的检验方法.doc

医疗机构污水和污泥中粪大肠菌群的检验方法 A1 仪器和设备 A1.1 高压蒸汽灭菌器。 A1.2 干燥灭菌箱。 A1.3 培养箱：37℃。 A1.4 恒温水浴箱。 A1.5 电炉。 A1.6 天平。 A1.7 灭菌平皿。 A1.8 灭菌刻度吸管。 A1.9 酒精灯 A2 培养基和试剂 A2.1 乳糖胆盐培养液 A2.1.1成分 蛋白胨 20g 猪胆盐（或牛、羊胆盐） 5g 乳糖 5g 0.4％溴甲酚紫水溶液 2.5mL 蒸馏水 1000mL A2.1.2 制法 将蛋白胨、猪胆盐及乳糖溶解于1000mL蒸馏水中，调整pH到7.4，加入指示剂，充分混匀，分装于内有倒管的试管中。115℃下灭菌20min。贮存于冷暗处备用。 A2.2 三倍浓度乳糖胆盐培养液 A2.2.1成分 蛋白胨 60g 猪胆盐（或牛、羊胆盐） 15g 乳糖 15g 0.4％溴甲酚紫水溶液 7.5mL 蒸馏水 1000mL A2.2.2 制法 制法同附录A2.1.2。 A2.3 伊红美兰培养基（EMB培养基） A2.3.1 成分 蛋白胨 10g 乳糖 10g 磷酸氢二钾 2g 琼脂 20g 2％伊红水溶液 20mL 0.5％美蓝水溶液 13mL 蒸馏水 1000mL A2.3.2 制法 将琼脂加到900mL蒸馏水中，加热溶解，然后加入磷酸氢二钾和蛋白胨，混匀使溶解，再加入蒸馏水补足至1000mL，调整pH至7.2～7.4。趁热用脱脂棉和砂布过滤，再加入乳糖，混匀，定量分装于烧瓶内，115℃灭菌20min。作为储备培养基贮存于冷暗处备用。 临用时，加热融化储备培养基，待冷至60℃左右，根据烧瓶内培养基的容量，加入一定量的已灭菌的2％伊红水溶液和0.5％美蓝水溶液，充分摇匀（防止产生气泡）。倾注平皿备用。 A2.4 乳糖蛋白胨培养液 A2.4.1成分 蛋白胨 10g 牛肉膏 3g 乳糖 5g 氯化钠 5g 1.6％溴甲酚紫乙醇溶液 1mL 蒸馏水 1000mL A2.4.2 制法 将蛋白胨、牛肉膏、乳糖及氯化钠加热溶解于1000mL蒸馏水中，调整pH到7.2～7.4，加入1.6％溴甲酚紫乙醇溶液1mL，充分混匀，分装于内有倒管的试管中。115℃下灭菌20min。贮存于冷暗处备用。 A2.5 革兰氏染色液 A2.5.1 结晶紫染色液 结晶紫 1g 95％乙醇溶液 20mL 1％草酸铵水溶液 1000mL 将结晶紫溶于乙醇中，然后与草酸铵水溶液混合。 A2.5.2 革兰氏碘液 碘 1g 碘化钾 2g 蒸馏水 300mL 将碘与碘化钾混合，加入蒸馏水少许，充分摇匀，待完全溶解，再加入蒸馏水至300mL。 A2.5.3 脱色液 95％乙醇。 A2.5.4 沙黄复染液 沙黄 1g 95％乙醇 2g 蒸馏水 90mL 将沙黄溶于95％乙醇中，然后用蒸馏水稀释。 A2.6 染色法 染色的基本步骤为：1）涂片：在载玻片上滴加一滴生理盐水，用灭菌的接种环取菌落少许，与生理盐水混匀，涂布成薄膜；2）干燥：在室温中使自然干燥；3）固定：将涂片迅速通过火焰2～3次，以载玻片反面接触皮肤，热而不烫为度；4）染色：滴加结晶紫染色液，染色1min，水洗；5）媒染：滴加革兰氏碘液，作用1min，水洗；6）脱色：滴加95％乙醇脱色，约30s，水洗；7）复染：滴加复染液，复染1min，水洗。 革兰氏阳性菌染色后呈紫色，革兰氏阴性菌染色后呈红色。 注：亦可用1：10稀释的石炭酸复红染色液作复染剂，复染时间为10s。 A3 检验程序 样品处理：确定样品接种量 发酵试验：将样品接种于乳糖胆盐培养液 平板分离：将产酸发酵管液接种于EMB 鉴定：挑取可疑菌落革兰氏染色、镜检 鉴定：挑取革兰氏阴性无芽孢杆菌接种于乳糖蛋白胨培养液 计数：根据产酸产气的阳性管数查MPN表 检验结果报告 A4 操作步骤 A4.1 样品准备 A4.1.1 污水 污水样品应至少取200mL，使用前应充分混匀。 根据预计的污水样品中粪大肠菌群数确定污水样品接种量。粪大肠菌群数量相对较少的接种量一般为10mL、1mL、0.1mL。粪大肠菌群数较多时接种量为1mL、0.1mL、0.01mL或0.1mL、0.01mL、0.001mL等。 接种量少于1mL时，水样应制成稀释样品后供发酵试验使用。接种量为0.1mL、0.01mL时，取稀释比分别为1:10、1:100。其它接种量的稀释比依此类推。 1:10稀释样品的制作方法为：吸取1mL水样，注入到盛有9mL灭菌水的试管中，混匀，制成1:10稀释样品。因此，取1mL1:10稀释样品，等于取0.1mL污水样品。其它稀释比的稀释样品