2014 免疫组织化学.ppt

免疫组织化学 一、免疫组织化学的定义 是指用已知的抗原或抗体去检测待检组织中的抗体或抗原，抗原抗体结合后再用一系列呈色反应，在光镜下观察，确定组织的来源、属性和部位。 目前免疫组织化学已成为科学研究及病理诊断中最重要的手段之一，而且已经普遍地展开并扩展至基层单位，为病理事业做出应有的贡献。 抗原（抗原，AG） 抗原是一类可以被机体的免疫系统识别，并刺激机体免疫系统合成和分泌免疫效应分子(抗体)，同时可以与免疫效应分子在体内或体外发生特异性结合的物质。 ㈠抗原的性质 异物性 它是抗原所具有的特性，机体对进入体内的某些异物、异体大分子物质可产生免疫应答。 理化性状 抗原分子量越大，其相应的表面积也越大，接触、碰撞免疫细胞的机会就增多，它的免疫原性就越强。 ㈠抗原的性质 特异性 各类抗原物质结构复杂，但能刺激机体并与抗体发生结合反应的成分，仅仅是抗原表面的活性化学基团、化学结构及空间构型，称为抗原决定簇。即一种抗体只能与相应的抗原起反应而不能与其它的抗原起反应，这就是抗原的特异性，称之为特异性抗原。但这种特异性是相对的。 ㈠抗原的性质 另外，不同的抗原物质常含有共同的抗原成份，即一种抗体可与两种以上不同抗原发生反应，这些抗原称为共同抗原。 ㈡抗原的类型 1.肿瘤相关抗原 2.分泌抗原 3.吞沉抗原 ㈢抗原的纯化 为了获得理想的抗体，使免疫组化技术达到定性可靠和定位准确的目的，不论是哪一种抗原，都必须进行纯化，以排除杂质，否则将会产生非特异性染色。 抗体（抗体, AB） 机体的免疫系统受到抗原刺激后，通过机体一系列的化合作用：即体液免疫应答、B淋巴细胞活化、增殖、分化为浆细胞，由浆细胞合成并分泌的仅与该抗原发生特异性反应的球蛋白物质称为抗体。 (一)抗体的种类 1.多克隆抗体(Polyclonal抗体,PCAB) 此类抗体成份较多，是多种单克隆抗体的混合物，可以跟抗原的多个决定簇起反应，故称多克隆抗体。 2.单克隆抗体（Monoclonal抗体, MCAB） 只能跟抗原中的某个决定簇起反应而获得的抗体称单克隆抗体。 二、免疫组织化学技术的发展概况 ㈠免疫荧光细胞化学技术 它的基本原理是把已知的抗原或抗体标记上荧光素，制成荧光抗原或抗体，然后以它作为探针来检测组织或细胞内的相应物质。在荧光显微镜下，根据其形成的复合物所发的荧光，来判断检测物的来源、性质和部位。 常用的荧光标记法 ①直接法：这是最早的方法。其基本原理是用已知的抗体标记上荧光素后成为特异性荧光抗体，染色时将该抗体直接滴在载玻片上进行孵育，使之直接与抗原结合，形成复合物。 评价：该法简单易行、特异性高、快速方便，常用于肾活检组织中免疫球蛋白和病原体的检测。但此法敏感性较差，只能检测相应的一种物质。 ②间接法：基本原理是用特异性的抗体与切片中的抗原结合后，继用间接荧光抗体，与前面的抗原抗体复合物结合，形成抗原抗体荧光复合物。 评价：本法发出的荧光亮度强，敏感性强。适用于多种第一抗体的标记显示，目前本法应用较广泛。但制作好的切片不能长期保存，影响资料的积累。 ㈡免疫酶细胞化学技术 这种技术的基本原理是通过共价键将酶结合在抗体上，制成酶标抗体，在检测时，抗原抗体复合物中带有标记上去的酶，可催化底物，在抗原抗体反应的部位上产生不溶性的有色产物，通过显微镜来观察判断，确定组织的来源、属性和部位。 ㈡免疫酶细胞化学技术 评价： 优点： 只需用普通光镜检查。 切片可长期保存，有利于资料积累。 可以会诊，所得结果较为客观。 既适用于冰冻切片，也适用于石蜡切片。 技术较为简单，易于普及和推广。 ㈡免疫酶细胞化学技术 存在问题： 酶与抗体间的共价结合可损害部分抗体和酶的化学结构。 酶标抗体分子量较大，对组织的穿透性较慢。 抗血清中的非特异性抗体被酶标记后与切片中的抗原结合，常可引起背景的染色，影响阳性物的判断。 敏感性不强，目前已不被使用。 ㈢非标记抗体酶法 由于酶标抗体存在许多问题，1974年Strernberger等人建立了非标记抗体酶法，其中最具代表的方法是过氧化物酶法即PAP法。 染色原理：应用第二抗体即桥抗体将抗原抗体复合物与PAP复合物连接起来，形成较大的复合物，利用复合物中辣根过氧化物酶HRP水解底物而呈色。 ㈢非标记抗体酶法 优点：PAP法具有较高的敏感性。 存在的问题： 1.第一抗体和第三抗体必须为同种属动物。如一抗为小鼠的，则三抗也必须为小鼠的。 2.抗体孵育时间过长。一抗要求置于4℃冰箱中过夜孵育，长时间的孵育容易产生背景染色，影响染色的成功率，而且容易掉片等。 3.复合物分子大，对组织的渗透力差，影响结果。 ㈣卵白素-生物素复合物法(ABC法) 它的原理是根据卵白素-生物