利用牵出技术分析与虾主要过敏原相互作用的蛋白质-生物通.PDFVIP

中国生物工程杂志　ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１２，３２（１１）：８１８５ 利用牵出技术分析与虾主要过敏原相互作用的蛋白质 沈梓粤　吕　哲　秦宗华　李任强 （暨南大学生物工程学系广东省分子免疫与抗体工程重点实验室　广州　５１０６３２） 摘要　目的：应用牵出技术研究与虾主要过敏原相互作用的蛋白质。方法：将纯化的虾主要过敏 原原肌球蛋白偶联在用环氧氯丙烷活化的载体Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ上作为配基并制成层析柱，以过敏原 为饵蛋白从虾过敏患者血清中钓出与之相互作用的蛋白质。结果：ＳＤＳＰＡＧＥ和间接ＥＬＩＳＡ检测 显示，由过敏原牵出的蛋白质至少有两种，分别是抗原特异性ＩｇＥ和ＩｇＧ，这说明虾过敏反应除了 是由ＩｇＥ所介导外，ＩｇＧ也在其中起到一定的作用。结论：实验所采用的牵出技术是一个快速且 有效的研究蛋白质相互作用的方法，其基于免疫亲和层析原理。 关键词　牵出技术　虾过敏原　蛋白质　相互作用 中图分类号　Ｑ８１６ 　　生命体内的许多生物学过程都依赖蛋白质与蛋白 １　材料与方法 质的相互作用。因此，研究蛋白质的相互作用对于了 解蛋白质结构与功能，揭开生命奥秘具有很重要的意 １．１　材　料 义。随着生物学研究的发展，研究蛋白质相互作用的 　　刀额新对虾（Ｍｅｔａｐｅｎａｅｕｓｅｎｓｉｓ）购自广州石牌市 方法已有很多，包括牵出技术（ｐｕｌｌｄｏｗｎ）、酵母双杂交 场；虾过敏患者血清由经临床检测为对虾有过敏反应 （ｙｅａｓｔ ｔｗｏｈｙｂｒｉｄ）、 免 疫 共 沉 淀 （ｃｏ 的患者提供。ＨＲＰ标记的鼠抗人ＩｇＥ和羊抗人ＩｇＧ、脱 ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ）等。 脂奶粉购自Ｓｉｇｍａ；Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ购自Ａｍｅｒｓｈａｍ；ＤＥＡＥ 　　牵出技术的原理是利用能相互作用的蛋白质之间 ＳｅｐｈａｒｏｓｅＣＬ６Ｂ购自北京鼎国昌盛有限公司；其他化 的亲和性，如酶与底物或抗原与抗体等的亲和性，通过 学试剂均为分析纯或化学纯，购自广州化学有限公司。 固定化的已标记的铒蛋白或标签蛋白，从细胞裂解液 １．２　虾主要过敏原的纯化与鉴定 中钓出与之相互作用的蛋白质，用以确定已知蛋白质 ［１１］ １．２．１　过敏原的纯化　纯化方法主要参考Ｃａｏ等 、 与钓出蛋白质之间的相互作用关系［１］。 ［１２］ 沈关心等 的方法略做修改。取新鲜虾肌肉与约２倍 　　 人体的免疫反应复杂多样，也是依赖蛋白质之间 体积（ｍ／Ｖ）的冰冷２０ｍｍｏｌ／Ｌ磷酸缓冲液（ｐＨ７．５，含 的作用。其中过敏反应也不例外， 型过敏反应主要 Ⅰ ５０ｍｍｏｌ／ＬＫＣｌ）混合后用组织捣碎机捣碎。匀浆离心 是由抗体免疫球蛋白Ｅ（ＩｇＥ）所介导，其影响了全世界 （４０００ｒ／ｍｉｎ，２０ｍｉｎ），将沉淀重新悬浮于２倍体积的磷 ［２］ ２５％以上的人口 。有研究发现过敏原特异性抗体免 酸缓冲液中并捣碎，再离心，取沉淀，如此重复３次，得 ［３４］ 疫球蛋白Ｇ（ＩｇＧ）也影响着过敏反应 ，但其在过敏 到肌原纤维。加入约３倍体积（ｍ／Ｖ）的冷丙酮于肌原 ［５７］ 反应中的角色一直备受争议 。为此，本实验基于牵 纤维中，作用３０ｍｉｎ后，离心（４０００ｒ／ｍｉｎ，２０ｍｉｎ），收集 ［８１０］ 沉淀，并用冷丙酮重悬，再离心收集沉淀。将沉淀转移 出技术的原理，将虾的主要过敏原原肌球蛋白 固