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免疫组织化学技术及其分析、免疫组化技术 注意事项应 用实验步骤免疫组化技术概 论标本器材与试剂免疫组织化学技术及其分析1.1.1 原理1.1.2 目的1.1.3 常用方法 1.1 概论 应用免疫学基本原理—抗原抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂显色(标记物有酶,荧光素等).来确定组织细胞内抗原，对其进行定位，定性，定量的研究.1.1.1 原理 检测组织细胞中相关抗原的分布及含量等 即组织细胞中的待测抗原 ，加入由酶、荧光素等标记的抗体 ，形成抗原抗体复合物 ， 加入显色剂， 在酶的催化下，显色剂发生化学反应，形成有色的沉淀物，沉积在细胞上 ，根据其染色位置、深浅 ，检测出待测抗原的分布区域以及含量等。1.1.2 目的1.1.3 免疫组化常用方法a. 含IgG的免疫复合物 b. 兔抗人IgG血清c. 羊抗兔IgG血清d. 兔PAP复合物免疫组化 PAP法1.1.3 免疫组化常用方法a. 含IgG的免疫复合物b. 兔抗人IgG血清 c.羊抗兔IgG血清d.抗生物素 e.生物素 f.辣根过氧化物酶 免疫组化ABC法1.1.3 免疫组化常用方法 直接免疫荧光法 间接免疫荧光法1.2 器材与试剂 器材： 微波炉、高压锅、微量加样器、修复盒、湿盒、染色架、 免疫组化笔 、防脱载玻片、盖玻片、脱水机、切片机、 石蜡包埋机、摊片机、 烤片机、冰箱、电磁炉、 计时器、微型漩涡震荡仪。免疫组织化学技术及其分析1.2 器材1.2 试剂 1.PBS ：0.01M磷酸盐缓冲液 （PH=7.4) 2.抗原修复液：0.01M柠檬酸盐（枸橼酸盐）缓冲液（PH=6.0) 3.固定液 ： 10%中性缓冲福尔马林：（甲醛1份+0.01M PH7.4的PBS 9份配制而成)，4%多聚甲醛等。 4.防脱剂：0.5%多聚赖氨酸。 5.包埋剂：石蜡。 6.一抗、免疫组化检测试剂盒。 7.TO生物透明剂、梯度酒精、3%H2O2 、中性树胶。 8.显色剂：苏木素染液 、DAB 试剂等免疫组织化学技术及其分析石 蜡切 片组织芯片 组 织 标 本冰 冻切 片细 胞 标本 病理切片 1.3 标 本组织印片 细胞爬 片细胞涂片 石蜡切片是制作组织标本最常用、最基本的方法，对于组织形态保存好，且能作/view/3873638.htm连续切片，有利于各种染色对照观察；还能长期存档，供回顾性研究。免疫组织化学技术及其分析1.4 实验步骤 石蜡 切片 制作 脱蜡 和 水化 抗原 修复 染 色..4免疫组织化学技术及其分析1.4.1 脱蜡和水化 石蜡切片 无水乙醇 （3min)TO透明剂(10min )TO透明剂(10min ) 80%酒精 （3min)PBS洗5min ×3次) 95%酒精(3min) 75%酒精(3min) 免疫组织化学技术及其分析1.4.2 抗原修复高压锅热修复法微波加热方法原理：通过热能，在某些化学物质的作用下，打开蛋白的交联键，暴露抗体所识别的抗原决定蔟。方法：切片脱蜡至水后，放入盛有缓冲液的修复盒中，置微波炉中火煮10分钟。冷却或放在流水中冷却. 注意：不可将切片从缓冲液中取出冷却，以免使蛋白恢复原有的空间构型。组织切片放入盛有抗原修复液的高压锅内,加筏后高压2分30秒.此方法可快速打开抗原决定簇,有利于抗原抗体的特异性结合,是目前常用的抗原修复方法。.免疫组织化学技术及其分析１.4.3常用免疫组化染色方法SP法EnVision法EPOS法SABC法CSAII法 SP法免疫组织化学技术及其分析 SP法1.特点：为生物素检测系统，需封闭内源性生物素，三步法染色。2.试剂盒：包含生物素标记的抗鼠/抗兔/抗羊免疫球蛋白工作液，标记HRP或AP的链菌抗生物素蛋白工作液 3.染色步骤：（1）组织切片经脱蜡水化后，按以下步骤进行：（2）PBS洗，3分钟×3次；（3）3% H2O2孵育10分钟，以灭活内源性过氧化物酶的活性。（4）必要时进行抗原修复（5）PBS洗，3分钟×3次；（6）正常血清封闭后滴加一抗，孵育30~40分钟或4℃冰箱夜；（7）PBS洗，10分钟×3次；（8） 滴加鼠/兔/羊二抗，孵育20~30分钟，（9） PBS洗，10分钟×3次；（10）滴加链菌抗生物素蛋白/HRP三抗，常温孵育30~40分钟；（11）PBS洗，5分钟×3次；1.4.5 .1 SP法（12） DAB显色,可在显微镜下观察染色程度；（13） 常水洗净；（14） 擦干后苏木素染色数分钟；（15） 流水冲洗；（16） 盐酸酒精分化，流水冲洗10分钟；（17） 脱水、透明、封片。 EnVision法免疫组织化学技术及其分析 EnVision法1.特点：为非生物素检测系统，