酶联免疫检测技术在农药残留研究.pptVIP

酶联免疫检测技术在农药残留研究中的应用 植物病理 吴小龙 ELISA技术在农药残留检测方面的应用研究现状 研究背景 应用现状 存在的问题及应用前景 1．研究背景 　　随着现代农业的发展 ,农药一方面在农业生产中发挥着越来越重要的作用 ,另一方面 ,由于农药的不合理使用也导致了严重的农药残留超标问题 ,影响人们的身体健康和农产品出口贸易。长期大量地使用农药 ,还会对生态系统的结构和功能造成严重危害。我国出口的农产品也因农药残留超标而屡屡发生被拒收、扣留、退货、索赔和撤消合同等事件 ,造成了巨大的经济损失 。 　　当前世界各国政府正在不断加强农药残留的监测工作，对农药残留检测灵敏度和效率的要求逐步提高，对快速检测分析新技术的开发也日益重视。 常规的农药残留分析方法如液相色谱法(HPLC)、气相色谱法(GC)、质谱(MS)法等，均存在着样品前处理复杂、仪器设备昂贵、分析费时长、要求熟练的技术人员才能完成等问题。 　因此 , 建立一套简便、快速、灵敏的药物残留的检测方法 , 同时采取有效的监控措施 , 减少和控制药物残留的发生势在必行。ELISA 检测技术特异性高、灵敏性强 , 所以对 ELISA 技术在农药残留检测中的研究和应用也越来越多 2．研究现状 1 . ELISA原理及分类 　　酶联免疫吸附测定技术(ELISA)是免疫技术与现代测试手段相结合的一种超微量的测定技术。 其原理是通过在合适的载体上，酶标限定量的抗原与未知抗原竞争固相抗体结合位点，形成抗体复合物。 在一定底物参与下，复合物上的酶催化底物使其水解氧化或还原成另一种带色物质，由于酶的降解产物与显色成正比，因此可通过酶标仪来测定，从而确定是否存在未知抗原及其含量。 ELISA 技术可用于测定抗原, 也可用于测定抗体。在这种测定方法中有 3 种必要的试剂: 固相的抗原或抗体、酶标记的抗原或抗体和酶反应的底物。根据试剂的来源和标本的情况以及检测的具体条件 , 可设计出各种不同类型的检测方法。ELISA 技术主要有间接法测定抗原、双抗体夹心法测抗原、双抗原夹心法测抗体、竞争法测抗体、竞争法测抗原、捕获包被法测抗体、ABS2ELISA 法、PCR2ELISA 法和斑点免疫吸附法等几种类型。 在双抗体夹心法测抗原中 , 包被抗体与酶标抗体都用单克隆抗体时, 不应采用识别同一位点的单克隆抗体 , 而应采用识别不同位点的 2 个单克隆抗体; 包被抗体与酶标抗体分别采用单克隆抗体和多克隆抗体时 , 宜用单克隆抗体作为包被抗体 , 用多克隆抗体作酶标抗体 。ELISA 技术的核心是抗原 (半抗原和免疫抗原) 的合成和抗体 (多克隆抗体和单克隆抗体) 的制备 。 2. ELISA技术在农药残留检测方面的应　　用研究现状 　 ELI检测法的优点是特异性强、灵敏度高、快速简便、可准确定性、定量，对使用人员的专业技术要求不高，容易普及、推广。 若开发成试剂盒，可广泛用于现场样品的测试，对比常规生物测定方法，更具准确可靠、方便快捷的优点。 目前国外已研制出几十种农药的酶联免疫试剂盒 , 对于免疫分析技术在农药快速检测中的应用研究十分活跃 , 包括有机磷类、拟除虫菊酯类、有机氯类、三嗪类、氨基甲酸酯类等 。 美国使用的ELISA试剂盒对有机磷农药的最小检出浓度达20μg/ kg,对氨基甲酸酯类农药的最小检出浓度达300μg/ kg。有些农药试剂盒使用测试管和配套的分光光度计检测,如美国Millipore公司生产的各种EnviroGard 试管测试试剂盒。 另一种较好的农药试剂盒是采用96孔酶标板和酶标仪进行分析,这种方法分析的样品量多且可重复实验,还可以定量测定。我国自行研制的农药残留检测试剂盒还很少,目前试剂盒的市场被国外公司占领,样品检测的成本较高,单个样品的检测费达80～100元,极大地限制了试剂盒的应用与推广,因此研究农药残留检测ELISA试剂盒具有很大的社会效益、经济效益和环境效益。 贾明宏等根据甲基对硫磷的结构特征，从甲基对硫磷的甲氧基部位连接了两种间隔臂，合成了两种半抗原，并通过活性酯法和混合酸酐法分别制备了与不同的载体蛋白偶联的人工抗原。 采用其中两种结合物进行动物免疫，得到了针对两种抗原的高效价抗体。 在此基础上，建立了两种甲基对硫磷的酶联免疫吸附测定方法。 结果表明，两种抗体对甲基对硫磷表现了很高的特异性，除了对硫磷以外，对结构相似的几种有机磷农药均无交叉反应。 土壤和河水中的添加回收实验结果表明，采用ELISA方法得到的回收率及变异系数(CV值)都与GC方法基本吻合，且检测灵敏度比GC法还高，符合农药残留分析的要求。 3 在各农药品种中的应用 1) 有机磷农药 　 A1S1 Hill 等 用半抗原杀螟硫磷 (FN) 与载体蛋白结合 , 制备了一系列