精子低温保存与精子功能.doc

 精子低温保存与精子功能 周俊彦 综述 程怀瑾 审阅 中国福利会国际和平妇幼保健院男性科 (上海 200030) 自 50 年代美国和日本相继用低温保存的精液 复温后作人工受精 , 并获得成功以来1 ～3 , 目前精 液低温保存在不育症的治疗 、生殖保险 、计划生育和 优生等领域得到广泛开展 。精子功能是影响人工受 精成功率的关键因素之一 ,而低温冻存及复温过程 中均会对精子的功能造成一定的损伤 ,为了尽可能 地减轻这种损伤 ,许多学者做了大量的研究 。现就 近年的研究和进展作一回顾 。 钟后再浸没于液氮 ( - 196 ℃) 中的方法 ,亦获得了较 好的冻存效果7 。 根据不同的方案可按实际情况选择不同的冻存 方法及降温速率 。在以往文献回顾报道中 ,精液冷 平衡的时间和温度对精子功能有一定影响 ,上述两 种方法的比较 ,在平均精子存活率和妊娠率上的报 告亦不尽相同5 。目前缓冻法仍作为主要采用的 方法 ,但在设备条件有限的情况下 ,速冻法也不失为 一种简便有效的措施 。 2 . 玻璃化低温保存法 玻璃化贮存 ,系指溶液 在降温过程中 ,相变后直接转变成非晶态 ( 玻璃态) 的固态 。由于玻璃态分子间的关系和液态没有明显 一 、精液低温冻存的基本原理及常用方法 低温环境能抑制生物体新陈代谢过程中的各种 生化活动 。根据 Arr heniu“s 温度对化学反应速度的 关系”的理论推测 ,在 - 196 ℃下生物体可望保存几 个世纪4 。近代大量的研究事实也证明了这一点 。 虽然生物体能在低温下长期保存 ,但却极易在降温 、 复温过程中遭受损伤 。因此只有掌握了低温冻存及 损伤的原理 ,才能获得高质量的冻融复苏精子 。 1 . 慢速冷却低温保存法 目前成功的精子低 温保存大多是采用慢速冷却法 。其原理是在精子冷 冻过程中 ,随着温度不断下降 ,细胞外液中的水分结 冰使溶液的浓度升高 ,细胞内的水分通过细胞膜渗 透至细胞外 ,造成自身不断的脱水皱缩 ,从而减少胞 内冰晶的形成 。然而高浓度的溶液长期作用将对细 胞产生致命的损害 ,因此除了选择最佳冷却速率 ,尚 须添加适宜的冷冻保护剂 。根据降温速率的不同 , 目前临床中常用的有缓冻法和速冻法两种 。 缓冻法即将精液Ο保护剂混合液缓慢降温至 2 ～4 ℃( 平均 0 . 6～0 . 8 ℃/ min) ,保持这一温度冷平 衡约 20～60 分钟 ,再以 1～2 ℃/ min 的速率降至约 - 30 ℃, 再 以 8 ～ 10 ℃/ 分 钟 的 速 率 降 至 - 80 ℃以 下 ,然后直接浸泡于液氮 ( - 196 ℃) 中保存5 ,6 。 速冻法与缓冻法的区别在于降温前期不做冷平 衡 ,利用液氮蒸汽直接降温 ,一般以 2～4 ℃/ 分钟的 速率降温至 - 30 ℃后 ,再按缓冻法的步骤冻存5 ,6 。 上海仁济医院采用静置于液氮液面上 ( - 65 ℃) 5 分 变化 ,从而可避免冰晶形成过程中对细胞的损伤 。 但是实现溶液玻璃化必须具备两个条件 : 一是极大 地提高冷却速率 ;二是增加溶液的浓度 。因此 ,目前 研究玻璃化贮存的重点仍是 : 一寻求容易实现玻璃 化而又对细胞损害较小的保护剂 ; 二是设法提高冷 却速率6 ,8 。随着现代物理化学技术的进展 , 玻璃 化贮存也许会成为低温保存的首选方案 。 3 . 复温方法 与冷却过程相比 ,复温过程的研 究显得薄弱得多 。在理论上严格地讲 ,正确的复温 过程应是冷却过程的函数 ,应针对不同的冷却过程 , 选择不同的复温过程 ,但目前的研究还极少 。由于 融化过程温度的控制要比冻结过程困难得多 ,为减 轻复温过程中冰晶及渗透肿胀对精子的损害 ,根据 实验研究认为 ,在绝对值上 ,复温速率一般要比冷却 速率高得多9 。目前临床上常用的精子复温方法 多采用 37 ℃水浴复温和室温复温两种 。一般认为 水浴温度在 26～40 ℃范围内 ,对精子的影响没有区 别8 。刘金刚比较了在 37 ℃、15 ℃水浴和冰水及室 温空气中自然复温 4 种方法 ,结果显示复温后精子 存活率均相似5 。 4 . 低温保护剂 低温保护剂的主要作用是稀 释溶液中的溶质浓度 ,减少冷冻和解冻过程中细胞 的渗透性损伤和减少冰晶的形成 ,根据其特性 ,一般 综 述 又分为渗透性保护剂 (如甘油等) 和非渗透性保护剂 (如单糖 ,卵黄等) 。目前常用的精液冷冻保护剂多 采用 T ESΟTrisΟ卵黄甘油复合剂和葡萄糖Ο枸橼酸盐 Ο卵黄Ο甘油复合剂等配方 。虽然甘油作为渗透性保 护剂获得了较好的冻存效果 ,但其对精子的毒性作 试验中除了少精症组 ,冷冻和新鲜精子的穿透率无 明