重组蛋白表达系统的选择.docVIP

重组蛋白表达系统的选择、表达策略和方法学研究 张 宁 1. 前言 在生命科学的很多研究和应用领域中，如何获得大量、均一、高纯、有活性的蛋白质都是一个关键问题。现代重组蛋白表达技术为我们提供了多种选择：传统的大肠杆菌、酵母、昆虫和哺乳动物细胞表达系统以及较新的植物和体外表达系统。每种表达系统都有很多成功的例子，但重组蛋白的个性不尽相同，没有任何一个系统和方法是普遍适用的，为目的蛋白选择一个恰当的表达系统也就成为表达工作的重中之重。 关于目的蛋白的一切信息，对表达系统的选择都是有帮助的，有几个最基本的问题一定要在表达之前回答清楚：目的蛋白的来源是原核还是真核生物？具有什么样的功能？分子量和聚合状态？是膜蛋白还是水溶蛋白？胞内表达还是分泌表达？是否需要以及需要何种翻译后修饰？有没有配体、底物或产物类似物可以利用？对蛋白酶是否敏感？有多少分子内及分子间二硫键？对目的蛋白的表达量、活性、表达速度和成本有怎样的要求？除了摸清目的蛋白的脾性，还要清楚各个表达系统的特点、优势和局限性，才能找到表达工作的大略方向，要获得最适合目的蛋白的表达方案，还需要在具体实验中调整优化。 表1比较了目前常用的表达系统的特点，并给出了粗略的适用范围。 　 大肠杆菌 酵母 昆虫细胞 哺乳动物细胞 流程 简单 简单 复杂 复杂 培养基 简单 简单 复杂 复杂 成本 低 低 中 高 产率 高 中 中 低 表达量 高 高 较高 较低 蛋白折叠 中 较好 较好 好 胞外表达 周质空间 分泌至培养基 分泌至培养基 分泌至培养基 细胞增殖周期 30min 90min 18H 24H 折叠 常有错误折叠 偶有不当折叠 正确折叠 正确 二硫键 难以形成 有 有 有 N-糖基化 无 甘露糖残基，高 无唾液酸，简单 复杂 O-糖基化 无 有 有 有 磷酸化 无 有 有 有 酰化 无 有 有 有 γ-羧基化 无 无 无 有 适用 原核蛋白、简单真核蛋白 真核蛋白、分泌表达蛋白 真核蛋白、分泌表达蛋白 复杂高等真核生物蛋白 表1：常用表达系统比较 2. 原核表达系统 原核表达系统发展完善、流程简单快速、成本低、产量高，对大部分蛋白来说都值得一试，尤其适宜于表达原核来源的以及不需要翻译后修饰的真核蛋白。 .1 表达菌株原核表达系统刚用的宿主菌有E. coli，Bacillus等。其中革兰式阳性的Bacillus更适宜在其周质空间分泌表达重组蛋白；革兰氏阴性的E. coli能够广谱表达异源蛋白。 大肠杆菌表达系统是目前发展最完善的重组蛋白表达系统。常用大肠杆菌菌株有BL21（DE3）、BL21（DE3）Star、B834（DE3）等，这些菌株都敲除了蛋白酶，并溶源了噬菌体DE3。DE3是的一种衍生λ噬菌体，带有噬菌体21抗性区和 lacI基因，lacUV5启动子，以及 T7 RNA聚合酶基因。这一区段被插入int基因，因此阻止了DE3在没有辅助噬菌体时整合到染色体上或从染色体切出。一旦形成DE3溶原状态，就只有受IPTG诱导的lacUV5启动子指导T7 RNA聚合酶基因转录，在溶原培养体系中加入IPTG诱导T7 RNA聚合酶生产，继而质粒上的目的DNA开始转录。同时，还有一些特殊设计的菌株以表达有特殊需要的重组蛋白，如甲硫氨酸营养缺陷型表达硒代甲硫氨酸蛋白，溶解性增强的菌株表达毒性蛋白，补充了稀有密码子的菌株表达真核蛋白等。 常用表达菌株 应用 抗生素抗性 B834 met营养缺陷性，对照株，不能使用T7启动子，蛋白酶敲除 无 B834(DE3) met营养缺陷性，蛋白酶敲除 无 BL21 对照株，不能使用T7启动子，蛋白酶敲除 无 BL21(DE3) 常规表达宿主菌，蛋白酶敲除 无 BL21(DE3) 高严紧表达宿主菌，蛋白酶敲除 氯霉素（34μg/ml） BL21trxB(DE3) 常规表达宿主菌，在E.coli胞质中形成二硫键，蛋白酶敲除 卡那霉素（15μg/ml） BL21trxB(DE3)pLysS 高严紧表达宿主菌，在E.coli胞质内形成二硫键，蛋白酶敲除 卡那霉素（15μg/ml）氯霉素（34μg/ml） Origami 对照株，不能使用T7启动子 四环素（12.5μg/ml）卡那霉素（15μg/ml） Origami(DE3) 常规表达宿主菌，更好的在E.coli中形成二硫键 四环素（12.5μg/ml）卡那霉素（15μg/ml） Origami(DE3)pLysS 高严紧表达宿主菌，更好的在E.coli中形成二硫键 四环素（12.5μg/ml）卡那霉素（15μg/ml）氯霉素（34μg/ml） Rosetta 对照株，不能使用T7启动子，蛋白酶敲除 氯霉素（34μg/ml） Rosetta(DE3) 常规表