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小鼠骨骼肌卫星细胞分离和纯化改良 　　【摘 要】目的：建立一种快速高效的小鼠骨骼肌卫星细胞的提取、纯化的实验方法，为进一步研究肌损伤与修复再生机制建立离体损伤模型奠定基础。方法：两步酶消化法结合差速贴壁技术并对其改良，分离出骨骼肌卫星细胞，并进行免疫组化鉴定。结果：改良后提取、纯化所得到的肌卫星细胞纯度可达到90%，明显高于普通方法。结论：本实验通过改良骨骼肌卫星细胞培养方法，使肌卫星细胞纯度明显增高。 【关键词】肌卫星细胞；分离；纯化 Mauro等[1]1961年首次在蛙骨骼肌中发现，肌卫星细胞是一种源于胚胎中胚层的干细胞。在发育成熟的个体，呈小单核梭形分布于肌纤维浆膜和基底膜之间，在正常情况下处于静息状态。当肌肉受到损伤等刺激时，则可进入有丝分裂循环，形成肌肉修复所需的细胞[2～4]。新生细胞可以相互融合形成新肌束，或融入已有肌束，以修复肌组织损伤。正是由于卫星细胞的这些特性，使其成为肌肉组织工程、基因工程和胚胎发育研究的新热点[5～6]。但肌卫星细胞的分离与纯化也成了亟待解决的问题，普通方法分离时含有大量的杂质细胞，本实验旨在提高肌卫星细胞的纯度。 1 材料与方法 1.1 材料 4～6周龄清洁级C57 BL/6小鼠（15～17 bg），雄性，由中国科学院上海实验动物中心提供。DF培养基、胎牛血清（FBS）、胰蛋白酶（Trypsin）均购自美国Gibico BRL公司。小牛血清（FCS）购自Hyclone公司。 1.2 方法 1.2.1 准备 取各种已消毒的培养用品置于净化台面，紫外线消毒30 min。开始操作前先洗手、75%酒精擦拭手至肘部。5～7日龄C57BL/10小鼠2只，DMEM/F12培养基，10% FCS+5% FBS，PBS缓冲液，0.25%胰蛋白酶，0.1%Ⅰ型胶原酶。 1.2.2 处理组织 将小鼠断颈处理，碘伏浸泡后，75%酒精浸泡消毒5 min，用消毒剪刀剪开下肢皮肤，剪断后肢，分离出股四头肌，将其置于培养皿中，PBS缓冲液漂洗2～3次，去除血污（如怀疑组织有污染，可先置于含有青链霉素的混合液中30～60 min）去除筋膜、 神经、脂肪和肌腱等，将股四头肌置于青霉素小瓶中用剪刀反复剪碎约1 mm组织3块。 1.2.3 消化及培养 将剪碎的组织块按15 mL/cm3比例加入0.1%Ⅰ型胶原酶消化时间为1.5～2 h，后加0.25%胰蛋白酶，将培养瓶置入37℃水浴箱中消化25 min，取上清离心（1200 r/min）5 min，（剩余组织在37 ℃水浴箱中继续消化25 min）将离心后的上清液弃去，用滤网滤除杂质后，用含10%FCS+5%FBS的DMEM/F12培养液将细胞滤液吹打数次，移入培养瓶内，在5% CO2孵箱中培养30 min，取出悬液移入另一无菌培养瓶中培养（连续差速贴壁2次）。将第二次消化的组织块混合液取出部分上清液离心（1200 r/min）5 min，弃去上清液，用含20%的FCS的DMEM/F12培养液将沉淀物吹打数次后移入培养瓶中，在5% CO2孵箱中培养。 1.3 骨骼肌卫星细胞的培养与鉴定 单层生长细胞：取对数生长期细胞，0.25%的胰蛋白酶消化，制成单细胞悬液。将细胞接种到预先放置的6孔培养板中，置CO2孵箱培养1～3天，待细胞接近长成单层，取出盖玻片，desmin免疫组化检测其纯度。 2 结果 2.1 骨骼肌卫星细胞的培养 从正常C57小鼠分离出股四头肌做细胞培养，刚经酶消化分离出的肌卫星细胞为球形，悬浮于培养液中。24h之后细胞即可贴壁，可以看到细胞形态成梭形、细小、单核、有折光性。原代细胞培养7d左右即可传代，传代的细胞生长状态良好，折光性好。细胞经低血清培养7～10 d左右就可以出现肌小管，在降低血清浓度条件下可以形成肌小管。 2.2 免疫组化鉴定细胞的纯度 desmin被认为是肌卫星细胞的特异性抗体，在骨骼肌卫星细胞胞浆中强阳性表达，胞浆染色呈棕色或棕黄色，成纤维细胞及其它杂质细胞不着色，所以用desmin鉴定肌卫星细胞的纯度（图1）。选取四代以内细胞用细胞计数方法计数阳性细胞，所得阳性细胞数见表1。 统计结果采用χ2检验，各组阳性率比较显示，P0.05。肌卫星细胞占90%以上。因此可以认为在做细胞免疫组化时可以选取四代以内的细胞，其结果差异无统计学意义。 3 讨论 由于卫星细胞被激活后与成肌细胞一样，均有同样增殖、分化、融合成肌管、再形成肌细胞的过程，因此对卫星细胞与成肌细胞的区分并不严格。对这两种细胞在本质上有无区别尚存争议，有的学者将卫星细胞理解为肌再生期的成肌细胞，有的则认为两种细胞存在的时期不一样以及主状态的差异（卫星细胞主要表现为静止状态）决定