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红色荧光蛋白(RFP)的原核表达 生物学实验教学中心 目 录 引言 1 1 实验材料 2 1.1实验材料 2 1.2实验试剂 2 1.3实验仪器 3 2 实验方法 3 2.1重组质粒pET-28a-RFP的构建。 3 2.2活化菌种 4 2.3 IPTG诱导RFP基因表达 4 2.4 蛋白质的提取 4 2.5 蛋白质的纯化 4 2.6 SDS检测表达蛋白 5 2.7数据分析与结果处理 6 3 结果与分析 7 3.1 IPTG诱导后菌液颜色及其表达蛋白粗提取 7 3.2 SDS检测表达蛋白 7 3.3 分析 7 总结 8 参考文献 9 红色荧光蛋白（RFP）的原核表达 摘 要：本实验通过分别将DH-5ɑ(pDsRed-N1)和DH-5ɑ(pET-28ɑ)提取质粒、酶切并连接形成重组质粒，将含有红色荧光蛋白（RFP）外源基因的质粒转入大肠杆菌体内。在活化、扩配含有目的基因的重组大肠杆菌后，用IPTG诱导RFP基因表达，在日光下可以看到菌液呈红色。将蛋白的粗提液经Ni+亲和层析得到纯化蛋白，根据SDS电泳检测蛋白的表达在中表达。Expression of RFP in Prokaryotes Abstract: This experiment, respectively, DH-5ɑ (pDsRed-N1) and DH-5ɑ (pET-28ɑ) plasmid was extracted, digested and connected to form the recombinant plasmid. The recombinant plasmid containing the foreign gene of red fluorescent protein (RFP) was transduced into E.coli in vivo. By activation and intermediate culture, the recombinant E. coli were inducted with IPTG, and the RFP was expressed. The red broth can be seen in daylight. The crude extracts of protein were purified by Ni+ affinity chromatography, and the RFP can be detected by SDSelectrophoresis. Results: RFP gene can be expressed steadily in prokaryotes cells Key words : RFP ; recombinant plasmid ; induction ; prokaryotic expression 缩略词表 简写 中文全称 RFP 红色荧光蛋白 GFP 绿色荧光蛋白 PBS 磷酸盐缓冲液 IPTG 异丙基硫代-β-D-半乳糖苷 SDS 十二烷基磺酸钠-聚丙烯酞胺凝胶电泳 RFP的原核表达 雷雅琪 （指导老师：王友如） （湖北师范学院生命科学学院 生物科学0801班 湖北 黄石 435002） 引言 红色荧光蛋白（RFP）是Matz等[1]从印度太平洋与海葵相关的Discosomasp中分离出来的一种能在紫外线的照射下可发射红色荧光的蛋白。RFP基因编码的蛋白质由225个氨基酸组成，相对分子质量（Mr）为25.9ku。它的一级结构与GFP的同源性很低，仅为23%，但它们的二级结构跟相似[2]。Baird等[3]研究了RFP的成熟动力学,发现室温下该蛋白最先形成绿色荧光生色团(最大吸收和发射波长分别为475和499 nm),其荧光强度在最高峰可维持7 h,然后逐渐降为零,历时2 d。与此同时,红色荧光在27 h达到最大强度的50%,48 h后,达到最大强度的90%。对RFP进行随机突变,得到了发射绿光的突变株。基于这个发现,人们推测RFP发色团形成的机制主要为:先形成GFP样的绿色阴离子发色团中间体(吸收和发射波长分别为480和500 nm),然后经过氧化反应,转变为成熟的红色荧光发色团(吸收和发射波长分别为558和583nm)。总之,RFP的发色团是GFP发色团的延伸[4]。实验结果表明,RFP的发色团只有在寡聚化的情况下才能形成及发挥作用。对RFP碱变性、酸变性及胍变性实验表明,RFP的发色团要经过几步折叠才可形成,而寡聚化在它的成熟过程中起重要的作用。 RFP已被广泛用于动物、植物、和酵母等真核细胞内基因表达的报告基因 [5-11]，其作为报告基因在原核细胞中的应用也越来越受关注[