细胞因子检测原理.ppt

细胞因子(cytokine, CK):由多种细胞分泌的具有广泛生物学活性的小分子蛋白,是细胞间信号网络的组成部分. 按结构与功能，分为白细胞介素（IL）、干扰素(IFN)、肿瘤坏死因子(TNF)、集落刺激因子(CSF)、生长因子(GF)、趋化性细胞因子(chemokine)等. 细胞因子作用的共性：高效性、多效性、短暂性等 细胞因子的检测方法 生物学活性检测方法 免疫学检测方法 分子生物学检测方法 细胞内细胞因子测定方法 一、生物学活性检测方法 由于各种细胞因子具有不同的活性，例如IL-2促进淋巴细胞增殖，TNF杀伤肿瘤细胞，CSF刺激造血细胞集落形成，IFN保护细胞免受病毒攻击. 1．细胞增殖法（根据某些细胞因子具有细胞生长因子活性） 淋巴细胞：T细胞、B细胞 依赖细胞株：IL-2依赖株CTLL-2 方法：3H-TDR掺入法、MTT法、CCK-8法等 2．靶细胞杀伤法（根据某些细胞因子能在体外杀伤靶细胞） 靶细胞：肿瘤细胞株 方法：同位素释放法、染料染色、MTT法、CCK-8法? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?? ??? MTT法：MTT是一种噻唑盐。活细胞内线粒体琥珀酸脱氢酶以MTT为底物，形成蓝色的甲臜（Formazan）颗粒沉积于细胞内或细胞周围，经ＤＭＳＯ溶解后为紫色溶液，可用酶标测定仪测定OD570的值。 一、生物学活性检测方法 3．细胞因子诱导的产物分析法（根据某些细胞因子可刺激特定细胞产生生物活性物质） 如：IL-2、IL-3诱导骨髓细胞合成胺 IL-6诱导肝细胞合成α1-抗糜蛋白酶 4．细胞病变抑制法  病毒可造成靶细胞的损伤，干扰素等则可抑制病毒所导致的细胞病变，因此可利用细胞病变抑制法检测这类因子。 生物活性测定法的缺点 1.需维持靶细胞株，操作繁杂、难定量； 2.特异性差是最主要缺点。 主要原因:细胞因子活性的交叉性。 提高特异性的方法：在测定样品中加入抗干扰性细胞因子的中和抗体，中和起干扰的细胞因子活性。 ELISA:生物素、亲和素放大系统引入酶标测定系统后，大大提高了酶联免疫吸附测定（ELISA）法的灵敏度。目前多数细胞因子的ELISA试剂盒可测至5～10 ng/L，已接近生理浓度，也达到放免法的灵敏水平。 优点：特异、方便、易标准化和批量化，很适合临床应用。 缺点：提供的是免疫活性信息而不是细胞因子生物活性信息。 ELISPOT ELISPOT技术利用结合在固相载体上的抗细胞因子的特异性抗体，在分泌细胞周围直接扑获待检细胞因子。实验中每个斑点（spot）是激活的淋巴细胞分泌的细胞因子区域，代表一个活性淋巴细胞。它可在单细胞水平检测淋巴细胞对特异性抗原的反应能力。 优点： 灵敏度高，是目前为止最灵敏的检测技术。可从20万-30万个细胞中检测到一个分泌该蛋白的细胞 单细胞水平、活细胞功能检测。 操作简便经济，可进行高通量筛选。 利用细胞因子的基因探针，检测特定细胞因子基因表达，即mRNA水平.通常采用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）、斑点杂交、Northern blot 。 缺点： 仅能检测基因表达情况，不能直接提供有关细胞因子的浓度和活性，只用于机制探讨; 假阳性 ? 生物学检测法比较敏感，又可直接测定生物学功能，是最可靠的方法，适用于各种实验目的，是科研部门最常用的技术，但需要长期培养依靠性细胞株，检测耗时长，步骤繁杂，影响因素多，不轻易熟练把握； 免疫学检测法比较简单，迅速，重复性好，但所测定的只代表相应细胞因子的量而不代表活性，同时敏感度也低于生物活性检测法（约低10～100倍）; 分子生物学法只能检测基因表达情况，不能直接提供有关因子的浓度及活性等资料，主要用于机制探讨。 将三种方法结合使用，可得到较为可靠的结果 适当活化条件先活化细胞，使之合成欲测细胞因子。由于活化过程中加入蛋白质运输抑制物，如莫能菌素等，阻断了胞内高尔基体介导的转运使得细胞因子聚集，蓄积，增强细胞因子信号可被流式细胞仪检测。这一方法可检测单个细胞内多个细胞因子，并可区分表达特定细胞因子的细胞亚群。 方法：流式细胞仪测定。 步骤：分离制备细胞、活化细胞、封闭细胞表面Fc受体、细胞表面抗原染色、固定和通透、细胞内细胞因子染色、流式细胞仪测定和结果分析。如双色标记IFNγ-FITC/IL-4-PE与CD3PerCP组合是同时研究TH1与TH2型免疫反应常用选择。 LOGO * LOGO 细胞因子的测定 细胞因子 ---基于细胞因子特定的生物活性设计的检测方法 CCK-8(Cell Counting Kit-8)法:原理同ＭＴＴ法。ＷＳＴ