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苏云金芽孢杆菌原生质体制备和再生探究 　　摘 要：主要研究了菌龄、酶浓度、酶解时间和酶解温度对苏云金芽孢杆菌原生质体制备和再生的影响。通过正交试验确定了苏云金芽孢杆菌制备和再生的最佳条件，当酶浓度为1.0mg/mL，酶解时间为80min，酶解温度为30℃时，原生质体的制备率和再生率达到最高，分别为98.14%和58.14%。 关键词：苏云金芽孢杆菌；原生质体；制备；再生 中图分类号 S476.1 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2014）03-04-20-02 引言 基因组改组技术是近几年迅速发展的微生物育种技术，在菌种特性改良和提高产量等方面取得了一系列成果[1]。原生质体制备、再生与融合技术是基因组改组育种的重要技术基础，由于各种微生物细胞壁的组成和结构不同，不同菌种原生质体制备和再生的条件也不相同[2-3]，较高的原生质体制备率和再生率是育种成功的必要条件。本研究拟开展苏云金芽孢杆菌基因组改组菌种选育，通过酶解法制备苏云金芽孢杆菌原生质体，主要研究了菌龄、酶浓度、酶解时间、酶解温度对原生质体制备和再生的影响，优化出原生质体制备与再生的最佳条件，为进一步进行原生质体的融合、选育优良重组的菌株奠定基础。 1 材料 1.1 菌种 苏云金芽孢杆菌FS42，本实验室保藏。 1.2 培养基 （1）斜面（平板）培养基（g/L）：牛肉浸膏3，蛋白胨10，氯化钠5，琼脂20。pH7.0～7.2。 （2）再生培养基（g/L）：牛肉浸膏3，蛋白胨10，氯化钠5，琼脂20，蔗糖171.15。pH7.0～7.2。 （3）种子培养液（g/L）：牛肉浸膏3，蛋白胨10，氯化钠5。pH7.0～7.2。 2 方法 2.1 菌种活化 从保种斜面挑取一环，平板划线，37℃恒温培养箱放置24h。 2.2 种子培养 从活化的平板上挑取成熟的单菌落接入种子培养基（装液量50mL/250mL三角瓶），置于 30℃ 230r/min恒温摇床振荡培养11h。 2.3 原生质体制备与再生 2.3.1 原生质体的制备 （1）挑取成熟的单菌落接入液体培养基（装液量50mL/250mL三角瓶），置于30℃ 230r/min恒温摇床振荡培养11h，2%转接新鲜的液体培养基（装液量50mL/250mL三角瓶），恒温摇床振荡培养3h，加3%的甘氨酸，继续培养4h。（2）吸取3mL菌液，加入3mL0.75mg/mL溶菌酶液，40℃水浴低速振荡60min。（3）吸取0.1mL菌液，用无菌水稀释至一定梯度，吸取0.1mL涂于平板上，37℃培养24h，计算其菌落数（A值）。 2.3.2 原生质体的再生 （1）用高渗缓冲液将制备好的原生质体悬液稀释至一定梯度，吸取0.lmL涂于再生培养基，37℃培养24h，计算其菌落数（C值）。（2）吸取0.1mL制备好的原生质体悬液，用无菌水稀释至一定梯度，静置20min，使其充分胀破，最后吸取0.1mL涂于平板上，37℃培养24h，计算其菌落数（B值）。 2.3.3 制备率和再生率计算公式 （1）制备率（%）=（A-B）/A×100；（2）再生率（%）=（C-B）/（A-B）×100。其中，A：总菌落数；B：未被酶解的菌数；C：原生质体再生菌数与未酶解菌总数。 3 结果与分析 3.1 单因素试验优化 3.1.1 溶菌酶浓度对原生质体制备与再生的影响 采用酶法制备苏云金芽孢杆菌FS42原生质，取预培养的菌液（接后培养3h，加3%甘氨酸，继续摇瓶培养4h），其它制备条件不变，溶菌酶浓度为0.5mg/mL、0.75mg/mL、1.0mg/mL，以考察不同浓度对原生质体制备与再生的影响，结果见图1。 从图1可以看出，当溶菌酶浓度为1.0mg/mL时，原生质体制备率达到最高，为82.63%，原生质体的制备率随酶浓度的增加而升高，但提高幅度较缓慢。当溶菌酶浓度为0.5mg/mL时，再生率达到最高，而随着酶浓度的增加，再生率逐渐下降，由12.1%下降至3.14%。由此可见，酶浓度的增加不利于原生质体的再生。虽然高浓度的酶制备率比较高，但再生率却很低。其原因可能是高浓度的溶菌酶使细胞壁被裂解得太彻底，进一步对原生质体产生毒害，使其失去再生能力，从而再生率下降。 3.1.2 酶解时间对原生质体制备与再生的影响 采用0.5mg/mL溶菌酶酶解，其它制备条件不变，分别酶解作用40min、60min、80min，考察不同酶解时间对原生质体制备与再生的影响，结果见图2。结果表明：酶解时间对其原生质体制备率和再生率有较大的影响。当酶解时间为60min，制备率与再生率的乘积达到最大，若继续延长裂解的时间，虽然制备率有略微上升，但其再生率快速下降，造