视网膜Müller细胞体外培养探究.docVIP

视网膜Müller细胞体外培养探究 　　摘要：Müller细胞是视网膜中有着重要作用的神经胶质细胞，针对该细胞的体外培养国内外也做了大量的工作，本文就目前视网膜Müller细胞的体外培养、分离、鉴定、纯化等方法的研究进展进行综述。 关键词：视网膜；Müller细胞；细胞培养 Müller细胞是视网膜神经胶质细胞中最主要和最重要的胶质细胞，参与了视网膜神经节细胞的代谢、内环境稳态以及神经递质的运输、摄取和代谢[1]。因而Müller细胞在视网膜神经节细胞的生长、损伤、修复和再生中起到重要的作用，是引起多种眼底疾病甚至导致失明的原因之一[2，3]。现今对视网膜Müller细胞的研究也经越来越受到重视，努力探寻一种最有效的体外培养视网膜Müller细胞的方法，以便更好的研究视网膜Müller细胞的功能及作用成为热点之一。 1培养板、培养皿的预处理 视网膜Müller细胞在体外能更好的培养生长，常常需要对培养板、培养皿进行包被预处理，这样有利于视网膜胶质细胞的贴壁生长，常用的包被物有鼠尾胶原、层黏连蛋白、多聚氨基酸等[4，5]。 1.1鼠尾胶原包被法 参照我国学者任海涛等[6]的方法，通过对SD大鼠鼠尾进行剥离取得鼠尾腱，用Tris-HCl 缓冲液、胃蛋白酶处理后获得鼠尾胶原蛋白原液、然后反复进行分级盐析、复溶得到鼠尾胶原蛋白。使用时用高纯度蒸馏水稀释成0.1mg/ml的质量浓度，再以50ul/cm2的量均匀涂抹覆盖于培养板、培养皿的全部底层表面，然后再室温静置放30min左右。吸除多余的的液体，予少量的灭菌蒸馏水洗涤，然后将水吸净即可。 1.2层黏连蛋白和多聚氨基酸包被法 用1ug/ml的层黏连蛋白或者0.1mg/ml的多聚氨基酸直接加入培养板、培养皿盖过内底板于37℃过夜[7]。或者先用多聚氨基酸包被2h，37℃，然后再吸净，然后加入层粘连蛋白覆盖全部底层表面，然后37℃过夜。吸净液体即可。 1.3我国学者赵丽萍等[8]得出各种支持物的效果大小依次为人羊膜上皮面、鼠尾胶原、多聚鸟氨酸、板素、纤维连接蛋白、人羊膜基底面、Ⅰ型胶原。但是因为羊膜的透明度比较差，在显微镜下难以辨认培养细胞的轮廓，实际使用比较少，而鼠尾胶原、多聚氨基酸胶原透明，操作简单，故常被首选使用。 2培养基 2.1含血清培养基 血清含有细胞生长必须的营养成分，能够促进体外培养细胞贴壁生长。血清可以增强视网膜神经胶质细胞在体外的存活率。 2.2无血清的合成培养基 无血清培养基按照细胞组分及浓度的差别，分为许多种类。马伟等使用无血清培养基（NeurobasalTM-A Medium）成功培养出视网膜神经细胞[9]。 3材料来源 在视网膜神经胶质细胞的体外培养中，眼球的来源主要选取哺乳动物如狗、树?[10]、兔、猪、鼠、猴、猫、人等。在实际实验中，人的眼球是最好的研究对象，但材料来源有限，而且涉及伦理学方面的问题，因而非常难得。鼠的大体解剖和人相似，大脑比较发达，新陈代谢较其他动物更接近人，价格比较适宜，被大多数学者作为取材对象，一般选取小于1w内的幼鼠[11，12]。 4视网膜Müller细胞的培养方法 4.1组织块培养法 在无菌条件下，将SD乳鼠断头处死，取出眼球，用含庆大霉素和青霉素的PBS液浸泡，在解剖显微镜下距锯齿缘1mm处剪开眼球，去除玻璃体及眼前节，剥取视网膜组织，将其剪成大小约2mm×2mm的视网膜组织，将其接种于培养瓶中，贴壁后加入含胎牛血清的培养基，放置于37℃含95%的氧气和5%的二氧化碳的培养箱中培养[13]。 4.2酶解法 在无菌条件下，将SD乳鼠断头处死，取出眼球，用含庆大霉素和青霉素的PBS液浸泡，在解剖显微镜下距锯齿缘1mm处剪开眼球，去除玻璃体及眼前节，剥取出视网膜组织后，将其剪成大小约1mm×1mm的视网膜组织，加入消化酶，放置于37℃含95%的氧气和5%的二氧化碳的培养箱中消化成单细胞终止消化，在1000r/min，4℃的条件下离心5min，弃上清。加入培养液，吹打成悬浮液，然后移入培养瓶中，放置于37℃含95%的氧气和5%的二氧化碳的培养箱中培养[13]。 5视网膜Müller细胞鉴定的方法 5.1倒置相差显微镜下观察 早期视网膜Müller细胞，具有比较典型的形态学特征： 胞体较大，略呈长梭形，胞质丰富，细胞核大，位于细胞中央或偏位，多呈椭圆形，有2个或2个以上的核仁，细胞有粗大突起[14]。但由于后期细胞形态变化大，因此不宜作为细胞鉴定的方法。 5.2透射电镜鉴定 Mano T等[15，16]把透射电镜下细胞内含直径为8～10nm的微丝作为Müller细胞的标志。 5.3免疫组织化学鉴定 常用的鉴定方法：一般认为该细