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HPLC测定恩替卡韦原料药含量和有关物质 　　【摘 要】目的：用反相HPLC法测定恩替卡韦原料药的含量及有关物质，为恩替卡韦原料药的含量和有关物测定提供检测方法，制定质控标准。方法：用十八烷基硅烷健合硅胶为填充剂，以乙腈-水-三氟乙酸（2：98：0.1）作为流动相，检测波长为254nm，柱温为室温。流速为1.0mLmin-1。结果：主峰能与相邻杂质峰较好分离，恩替卡韦的浓度在0.06～0.14 mgmL-1范围内线性关系良好，相关系数为0.9992。结论：该法简便、准确、专属性好，可用于恩替卡韦原料药的含量及有关物质的测定。 【关键词】恩替卡韦；含量测定；有关物质；高效液相色谱法 【中图分类号】R917 【文献标识码】A 【文章编号】1004-7484（2013）02-0293-02 恩替卡韦是由美国百时施贵宝（Bristol ? Myers Squbb）公司在20世纪90年代开始研制开发的一种新型抗乙肝病毒新药，对HBV、DNA复制的起始、逆转病和DNA正链合成等3个阶段均起抑制作用，具有很高的抗HBV作用，且细胞毒性很低[1]，属于已在国外上市销售但尚未在国内上市销售的原料药。关于本品的含量测定和有关物质检查国内外尚未见国内外文献报道。本文采用RP-HPLC法测定恩替卡韦的含量和有关物质，并选用常用的C18柱。本法灵敏度高，专属性强，重现性好，结果准确可靠。 1 仪器和试药 LC2050高效液相色谱仪，LC2030型紫外检测器，LC2130 泵（均为上海天美科学仪器有限公司生产）；乙腈（色谱纯） ；盐酸与氢氧化钠（均为分析纯）；样品：恩替卡韦原料药（自制，批号20090602；对照品：恩替卡韦（美国进口，含量为99.5%，）。 2 色谱条件及系统适用性试验 色谱柱：waters C18柱（250mm×4.6mm，5μm） ；流动相为乙腈-水-三氟乙酸（2：98：0.1）；流速：1mlmin-1；检测波长为254nm；柱温：室温，理论板数按恩替卡韦峰计不低于10000，各杂质峰均能与主峰基线分离。结果见图1。 A.空白（blank） B.恩替卡韦样品（ entecavir sample） 1.恩替卡韦（entecavir） 3 方法与结果： 3.1 溶液的制备 3.1.1 对照品溶液的制备 精密称取对照品10.25mg，置100ml容量瓶中，加0.1%三氟乙酸溶解并稀释至刻度，摇匀，滤过，即得。 3.1.2 供试品溶液的制备 精密称取样品10.59mg，置100ml容量瓶中，加0.1%三氟乙酸溶解并稀释至刻度，摇匀，滤过，即得。 3.2 方法专属性考察 取本品适量，分别进行以下操作：①热破坏：取本品适量，置表面皿中铺成≤5mm厚的薄层，置于200℃干燥箱加热破坏1小时。称取本品适量，加0.1%三氟乙酸制成每1ml约含0.1mg浓度的溶液，滤过，即得；②酸破坏：取本品约10mg，加浓盐酸溶液5ml，置水浴中加热30分钟，放冷，用饱和氢氧化钠溶液中和后，转移至100ml量瓶中，用0.1%三氟乙酸稀释到刻度，摇匀，滤过，即得；③碱破坏：取本品约10mg，加饱和氢氧化钠溶液5ml，置水浴中加热2小时，放冷，用浓盐酸中和后，转移至100ml量瓶中，用0.1%三氟乙酸稀释到刻度，摇匀，滤过，即得；④氧化破坏：取本品约10mg，加入30%过氧化氢溶液1ml，置水浴中加热2小时，转移至100ml量瓶中，用0.1%三氟乙酸稀释到刻度，摇匀，滤过，即得。结果上述操作方法中有关物质含量显著增加，且降解产物均与恩替卡韦主峰获得良好分离，表明本色谱条件测定恩替卡韦的含量及其有关物质的方法专属性良好。见图2。 3.3 线性范围 精密称取恩替卡韦对照品适量，用0.1%三氟乙酸稀释成每1ml约含0.06、0.08、0.10、0.12和0.14mg的溶液，摇匀，分别取各溶液20μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，量取峰面积。以恩替卡韦的峰面积（A）为纵坐标（Y），以对照品的浓度C（mgmL-1）为横坐标（X），按最小二乘法进行线性回归，求得线性回归方程：A8C+63621.28 r=0.9992。 恩替卡韦在0.06～0.14mgmL-1 浓度范围内，线性关系良好。 3.4 进样精密度 取线性关系考察项下浓度为0.10 mgmL-1的对照品溶液，连续进样6次，记录峰面积，结果RSD为0.25%。 3.5 稳定性试验 精密称取批号样品适量，加流动相制备成0.10mgmL-1L的溶液，摇匀，作为样品溶液，分别在0，2，4，6，8h取样，测定峰面积。结果RSD为0.45%，表