《动物寄生虫病学》许金俊-实验八 动物蠕虫病的实验室常规诊断.docVIP

实验八 动物蠕虫病的实验室常规诊断 一、实验目的和要求 通过实习，认识动物蠕虫病实验室常规诊断方法的一般原理。掌握粪便中虫卵检查的原理和方法，以及虫卵识别的基本特征；掌握粪便虫卵计数与显微测量虫卵大小的原理与方法；了解粪便中虫体检查、幼虫分离检查的方法；了解粪便毛蚴孵化法的操作技术；了解肛周刮取物、尿液、气管和鼻腔分泌物与血液中蠕虫卵或幼虫的检查方。 二、实验材料 猪、牛、羊粪便各200克，60目铜筛漏斗，260目锦纶筛兜，25ml锥形瓶，50ml和100ml烧杯，500ml三角量杯，吸管，平皿，载玻片，盖玻片，玻棒，镊子，甘油与水（1：1）等量混合溶液，0.1M NaOH，盐类或糖类饱和溶液，研钵，玻璃珠，麦克马斯特计数板，贝尔曼氏幼虫分离装置，目测微尺和台测微尺，双目生物显微镜，台式离心机，恒温培养箱等。 三、实验内容及操作步骤(带*为学生自己操作内容，其余为指导教师进行示教内容) (一)、粪便检查 粪便检查必须采用新鲜粪便，必要时对大家畜可进行直肠内直接采粪，对一般家畜可进行清水灌肠采样。采样量大家畜至少100g，草食兽的采粪量必须多于肉食兽。采样时力求代表性，必须同时采取粪便的内外各层。如果粪便不能当日进行检查，则应放在普通冰箱内或阴冷处，以抑制虫卵和幼虫的发育和防止粪便的发酵。如需转送他处检查的，则可将粪样浸入5-10﹪的甲醛，将病原体固定，使其丧失活动。 1虫体检查法* 在消化道内寄生虫的绦虫常以含卵节片（孕卵节片）整节排出体外。此外，有时一些寄生虫的完整虫体因其寿命或驱虫药的影响等原因而排出体外。粪便中的节片和虫体，其中较大型者，易被发现，对较小的应先将粪便收集于盆（或桶）内，加入5～10倍的清水，搅拌均匀，静置待自然沉淀，尔后将上层液体倾去，重新加入清水，搅拌沉淀，反复操作，直到上层液体清澈为止，最后将上层液倾去，取沉渣置于大玻璃皿内，先后在白色背景和黑色背景上，以肉眼或借助于放大镜寻找虫体，发现时用铁针或毛笔将虫体挑出供检查。 2粪便虫卵检查* 粪便中虫卵检查方法有直接涂片法和集卵法两种。集卵法总的原则是利用各种方法，将分散在粪便中的虫卵集中起来，再行检查，以提高检出率。所采用的方法一般有两种类型，一是利用虫卵和粪渣中其它成分比重的差别，将虫卵集中；二是利用孔径大小不同的金属筛，过滤粪液，使虫卵与粪渣分开，并且将虫卵集中。集卵法常有漂浮法、沉淀法和锦纶筛兜淘洗法三种，其方法的设计必须达到三项要求：病原检出率要高；第二，操作方法要简单；第三，符合经济原则。 （1）直接涂片：取清洁的载玻片一张，加入少许粪便，上面滴加1～2滴甘油水溶液，用竹签搅拌均匀并涂成一薄层，厚薄以玻片置于纸上能隐约看见字迹为宜，剔除较大的粪渣，盖上盖玻片，置显微镜下观察，先用低倍镜顺序查盖玻片下所有部分，发现疑似虫卵物时，再用高倍镜仔细观察。如图8-1。直接涂片法是简单和最常用的方法，但检查时因被检查的粪便极少，检出率也教低。本法用于产卵较多的蠕虫如蛔虫、捻转血矛线虫、毛圆线虫等。同一粪样要求至少重复检查3次，除此之外，还可以采用回旋法和玻璃纸厚层涂片法（加藤法）检查。回旋法步骤为：取2～3g粪样加清水2～3倍，充分混匀成悬液。后用玻璃棒搅拌0.5～1min，使之成回旋运动，在搅拌过程中迅速提起玻璃棒，将棒端附着的液体放于载片上涂开，加上盖片在镜下检查。检查时多取几滴悬液。该方法的原理是由于回旋搅动的结果，可使玻璃棒端悬液小滴中附有较多量的寄生虫卵或幼虫。加藤法玻璃纸厚层涂片法步骤为：取约5mg（已用100目不锈钢筛除去粪渣）粪便，置于载玻片上，覆以浸透甘油－孔雀绿溶液的玻璃纸片，轻压，使粪便铺开（20×25mm）。置于30～36℃温箱中约半小时或25℃约1小时。待粪膜稍干，即可镜检。玻璃纸准备：将玻璃纸剪成22×30mm大小的小片，浸于甘油－孔雀绿溶液（含纯甘油100ml、水100ml和3孔雀绿1ml的水溶液）中，至少浸泡24小时，至玻璃纸呈现绿色。使用此法需掌握粪膜的合适厚度和透明的时间。如粪膜厚，透明时间短，虫卵难以发现；如透明时间过长，则虫卵变形，也不易辨认。 图8-1直接涂片法操作过程示意图 （2）漂浮法:其原理是用一些比重大于虫卵的盐类或糖类饱和溶液作漂浮液，将粪便虫卵浮集于液体表面，从而提高检出率。本法使用于检查大多数线虫卵和绦虫卵，操作时要根据所检查虫卵的比重选择相应的漂浮液。一般采用饱和氯化钠溶液，除特殊需要外。采用过大比重溶液是不适宜的。因为加大了比重会浮起更多的粪内杂质，发而影响检出率。过浓的溶液粘稠度增加，使虫卵浮起的速度减慢。各种漂浮液的比重和特点见下表。 漂浮液 比重 特点 配制 饱和氯化钠 1.200 优点：盐份不分解价格低廉 缺点：使原虫包囊和幼虫破坏 400g加1000ml煮沸到不再溶解， 冷却后过滤或不