现代生物仪器分析第三章 分子荧光光谱法.pptVIP

第三章 分子荧光光谱法 重点部分 荧光分析的基本原理 荧光和分子结构的关系 荧光分析仪的基本类型及分析原理 分子荧光分析的应用 难点内容 荧光产生机理 荧光和分子结构的关系 基本概念 荧光效率 荧光猝灭 振动驰豫 荧光法具有很强的检出能力，其检出限通常低于吸收光度法2～4个数量级，选择性也比吸收光度法好。 许多重要的生化物质，药物和致癌物质（多环芳烃）都能产生荧光，因此荧光分析法在药物分析，临床分析，环境分析及食品分析中占有重要的地位。 在无机物分析中，荧光法也有较广泛的应用。 荧光属发射光谱范畴。光致发光包括荧光和磷光。 发光光谱:物质分子或原子吸收辐射被激发后,电子以无辐射跃迁至第一电子激发态的最低振动能级,再以辐射的方式释放这一部分能量而产生的光谱称为 荧光,磷光. 第一节?? 分子发光分析法 分子发光分析主要包括: 荧光分析 磷光分析 化学发光分析 若分子吸收了光能而激发到较高能态，在返回基态时，发射出与吸收波长相等或不等的辐射，这种现象称为光致发光。 光致发光最常见的类型是荧光和磷光。 荧光和磷光这两种光致发光过程的机理不同，可从实验观察激发态分子寿命的长短来加以区别： 对于荧光来说，当激发光停止照射后，发光过程几乎立即停止（在10-9～10-6秒，荧光寿命fluorescence life time ）。 磷光则将持续一段时间（在10-3～10秒）。 荧光分析法发展简史 世界上第一次记录荧光现象是16世纪西班牙的内科医生和植物学家N.Monardes。 1575年他提出在含有一种木头切片的水溶液中，可观察到极可爱的天蓝色。 1852年，stokes在考察奎宁和叶绿素的荧光时，用分光光度计观察到其荧光的波长比入射光的波长稍微长些，从而导入了荧光是光发射的概念。 1867年，Goppelsroder进行了历史上首次的荧光分析工作。应用铝—桑色素配合物的荧光进行铝的测定。 19世纪以前，荧光的观察是靠肉眼进行的，直到1928年，才由Jette和West完成了第一台荧光计。 第二节 荧光分析的原理 （一）荧光发生机理 物质的基态分子受一激发光源的照射，被激发至激发态，在返回基态时，产生波长与入射光相同或较长的荧光。 1、分子的激发态 分子在基态时通常具有多对自旋成对的电子，根据包里不相容原理，在一个轨道上运动的两个电子的自旋方向是相反的。配对电子自旋总和是零。 激发的单重态：分子吸收能量后，若电子在跃迁过程中不发生自旋方向的变化，这时分子处于激发的单重态(single state)。 用符号S表示。 激发单重态与激发三重态的性质不同 荧光：10-7～10-9s,第一激发单重态的最低振动能级→基态； 磷光：10-4～10s；第一激发三重态的最低振动能级→基态 单重态分子为反磁性，三重态分子为顺磁性的。 激发单重态的平均寿命约为10-8s，而激发三重态的平均寿命长达10-4～10s以上。 基态单重态到激发单重态的激发容易发生，基态单重态到激发三重态的几率只相当于前者的10-6。 2、分子荧光和磷光的产生 分子在室温时基本上处于电子能级的基态。当吸收了紫外—可见光后，基态分子中的电子只能跃迁到激发单线态的各个不同振动—转动能级，根据自旋禁阻规律，不能直接跃迁到激发三重态的各个振--转能级。 处于激发态的分子是不稳定的，它可能通过辐射跃迁和无辐射跃迁等分子内的去活化过程释放多余的能量而返回至基态，发射荧光是其中的一条途径。 振动弛豫vibrational relaxation 在溶液中,处于激发态的溶质分子与溶剂分子间发生碰撞,把一部分能量以热的形式迅速传递给溶剂分子(环境),在10-11~10-13 秒时间回到同一电子激发态的最低振动能级,这一过程称为振动弛豫. 因能量不是以光辐射的形式发生，故振动弛豫属无辐射跃迁。 振动弛豫只能在同一电子能级内进行，时间为10-12S数量级。 （2）内转换（内部能量转换 ）internal conversion 当两个电子激发态之间的能量相差较小，以致其振动能级有重叠时，受激分子常由高电子能级以无辐射跃迁转移至低电子能级。 当激发态S2 的较低振动能级与S1的较高振动能级的能量相当或重叠时,分子有可能从S2 的振动能级以无辐射方式过渡到S1 的能量相等的振动能级上, 这一无辐射过程称为内转换. “ 内转换”过程同样也发生在三重激发态的电子能级间 是相同多重度的能态之间的一种无辐射跃迁，跃迁过程中电子的自旋不改变，如Sm~→Sn , Tm~→Tn ，时间10-12秒. （3）荧光发射fluorescence emission 当激发态的分子通过振动驰豫—内转换—振动驰豫到达第一单重激发态的最低振动能级时,第一单重激发态最低振动能级的电子可通过