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人LTF基因真核表达载体构建 　　【摘 要】LTF基因表达产物乳铁蛋白为一种多功能糖蛋白，其具有调节免疫，抗炎、抗微生物、抗肿瘤等多种生物学功能。LTF在鼻咽癌中表达下调，但其在鼻咽癌中的功能尚未完全明确。为探讨LTF与鼻咽癌的关系，本研究以人cDNA为模板， PCR扩增LTF全长开放读码框，再将其定向插入真核表达载体， 测序鉴定序列和插入方向正确。LTF真核表达载体成功构建，为进一步探索LTF基因在鼻咽癌细胞内的功能奠定基础。 【关键词】真核表达载体；LTF；载体构建 乳铁蛋白（Lactoferrin， LTF） 是一种铁结合性糖蛋白，具有广泛的生物学活性。它不仅参与体内铁的转运及代谢、机体免疫调节，还具有抗炎症、抗微生物及抗肿瘤等活性。 鼻咽癌的发生是多因素、多阶段、多步骤的过程，遗传因素是其发生的重要因素之一。研究显示，LTF在慢性鼻咽炎中表达正常，在鼻咽癌中表达下调[1]，提示LTF可能是鼻咽癌候选抑瘤基因。本实验构建了LTF 基因真核表达载体为进一步进行LTF 基因体内外功能研究奠定了基础。 一、材料和方法 （一）菌株和载体 E.Coli DH5α菌株；pMD18-T载体 （Takara）是一种高效克隆PCR产物（专用载体，有 Ampr 抗性；pcDNA3.1（-）载体（Invitrogen）含CMV启动子，具有Ampr和Neor抗性，在真核细胞中高效表达。 （二）试剂 高保真聚合酶（LATaq， Takara）；HindIII、XbaI等内切酶、T4 DNA Ligase（Fermentas）；质粒抽提试剂盒、DNA胶回收试剂盒（Qiagen）；逆转录试剂盒（Promega）。 （三）方法 （1）引物设计和酶切位点分析 （1）LTF基因ORF引物设计 LTF mRNA序列（NM_002343.2），ORF扩增引物（目的片段2171bp），上游：5’-CGCCTCCAGACCGCAGACATGAAACTT-3’；下游：5’-CTGGGCCATCTTC TTCGGTT TTACTTC-3’。GAPDH引物（目的片段550 bp），上游：5’-CCACCCATGGCA AATTCCTCCATGGCA-3’；下游：5’-TCTAGACGGCA GG TCAGGTCCACC-3’。 （2）酶切位点分析 Webcutter 2.0分析LTF序列，结合pMD18-T和pcDNA3.1（-）载体特点，选用HindIII和XbaI作为多克隆位点。 （2） RT-PCR扩增LTF基因ORF 慢性鼻咽炎组织总RNA抽提，两步法RT-PCR获得cDNA。 （3）目的片段与克隆载体连接 （1）PCR产物与pMD18-T 载体连接：PCR纯化产物 4μL，pMD18-T 1μL，缓冲液 5μL，补ddH2O至50 μL，16 ℃ 20 h。 （2）连接产物转化及鉴定：①质粒转化，菌落PCR鉴定。②质粒抽提和鉴定：挑阳性克隆培养，试剂盒抽提。③鉴定：a. HindIII/XbaI双酶切。b. 测序鉴定。 （4）LTF真核表达载体的构建 （1）目的片段插入真核表达载体：取质粒pMD18-T/LTF和pcDNA3.1（-），分别Hind III/Xba I双酶切，回收目的片段，体外连接，体系如下：10×buffer 2μL，T4 DNA连接酶1μL，LTF目的片段 3μL，pcDNA3.1（-）线性片段1μL，加ddH2O至20μL，15 ℃ 18 h，65 ℃ 10 min。连接产物转化DH5α感受态。 （2）阳性克隆鉴定：方法同前。 二、实验结果 （一）以cDNA为模板扩增LTF基因ORF RT-PCR方法从慢性鼻咽炎组织cDNA中克隆LTF基因ORF。PCR产物经0.8 %琼脂糖凝胶电泳显示片段大小正确（约2.2kb）（图1）。 图1 RT-PCR扩增LTF ORF（0.8%琼脂糖凝胶） M：DL2000；Lane1-2：慢性鼻咽炎组织（GAPDH：550bp，LTF ORF：2171bp）。 （二）LTF基因ORF TA克隆载体的构建 PCR扩增的LTF基因 ORF产物进行TA连接、转化，挑Amp阳性克隆，PCR鉴定，第1-5号克隆可扩增出目的片段（图2A）。挑第5号克隆抽质粒，HindIII/XbaI双酶切，酶切产物电泳（图2B）。测序鉴定显示LTF基因ORF序列正确，并正向连接到pMD18-T载体。重组质粒命名为pMD18-T/LTF。 图2 LTF基因TA菌落克隆PCR和质粒HindIII/XbaI双酶切鉴定（0.8 %琼脂糖凝胶） M：DL2000；图2A La