淀粉磷酸化酶原核表达及单克隆抗体的制备-博奥龙免疫.pdfVIP

中国农学通报 2017,33(14):28-32 Chinese Agricultural Science Bulletin 淀粉磷酸化酶原核表达及单克隆抗体的制备 余厚美，安飞飞，罗秀芹，陈松笔，欧文军 （中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所/农业部木薯种质资源保护与利用重点实验室，海南儋州571737） 摘 要：旨在体外表达淀粉磷酸化酶，免疫小鼠制备单克隆抗体。用PCR 扩增木薯淀粉磷酸化酶基因， 将其克隆到原核表达载体(pET28a ) 中，经E.coli 表达纯化淀粉磷酸化酶。用纯化的淀粉磷酸化酶蛋白免 疫Babl/c 小鼠，间接ELISA 测定小鼠血清效价，取小鼠脾细胞与小鼠SP2/0 细胞融合，制备能产生抗淀 粉磷酸化酶单克隆抗体的杂交瘤细胞株，并检测其亚型和抗体稳定性。重组质粒在E.coli 中能高效表 达淀粉磷酸化酶，免疫小鼠后取效价高的3# 小鼠脾脏细胞和SP2/0 细胞融合，共获得15株抗体效价均 5 达到10 以上，能稳定分泌抗淀粉磷酸化酶抗体的细胞株，与钙调蛋白、牛血清白蛋白无交叉反应，抗体 亚型鉴定其中13株为IgG 型抗体，其中2 株抗体性能非常稳定。本实验制备的淀粉磷酸化酶单克隆抗 体效价高、特异性强、稳定性好，为后续木薯中淀粉磷酸化酶研究奠定基础。 关键词：木薯；淀粉磷酸化酶；蛋白表达；单克隆抗体 中图分类号：S-3 文献标志码：A 论文编号：cas StarchPhosphorylaseProkaryoticExpressionandPreparationofMonoclonalAntibodies YuHoumei,AnFeifei,LuoXiuqin,ChenSongbi,OuWenjun (TropicalCropsGeneticResourcesInstitute,ChineseAcademyofTropicalAgriculturalSciences/KeyLaboratoryofMinistryof AgricultureforGermplasmResourcesConservationandUtilizationofCassava,DanzhouHainan571737) Abstract: The aims are to express starch phosphorylase in vitro, and prepare monoclonal antibodies in immunizedmice.Starchphosphorylasegenesofcassavawereamplifiedbypolymerasechainreaction(PCR) andthenclonedintotheprokaryoticexpressionvector(pET28a),thestarchphosphorylasewasexpressedinE. coli andthenpurified.ThepurifiedstarchphosphorylasewasusedtoimmunizeBabl/cmiceandthetiterof miceserumwasdeterminedbyindirectELISA.MousespleencellsandmurineSP2/0cellswerefused,and thenhybridomacelllineswhichcouldproducestarchphosphorylasemonoclonalantibodywereprepared,the subtypes and stability of antibody were detected. Recombinant plasmid in E.coli could express starch phosphorylaseefficiently,SP2/0cellsandspleencellsof3#micewerefused,then15strainswithantibody titermorethan105 wereobtained,andtheantibodiescouldagain