熊果酸对HL―60细胞株凋亡和Bcl―2与bax表达影响.doc

熊果酸对HL―60细胞株凋亡和Bcl―2与bax表达影响 　　[摘要] 目的 探讨熊果酸（UA）抑制人急性髓性白血病细胞系（HL-60）细胞增殖和诱导凋亡作用，并观察Bcl-2和bax基因表达的影响。方法 体外培养HL-60细胞。MTT比色法检测增殖活性；流式细胞术（FCM）检测细胞凋亡和细胞周期分布；Western Blot分析Bcl-2和bax基因表达。 结果 UA显著抑制HL-60细胞增殖，呈浓度依赖性；UA呈浓度依赖性诱导HL-60细胞凋亡，明显阻滞于细胞周期G1期；UA以浓度依赖方式下调Bcl-2蛋白表达和上调bax蛋白表达。 结论 UA抑制HL-60细胞增殖和诱导凋亡，其作用机制与下调Bcl-2上调bax蛋白表达相关。 [关键词] 人急性髓性白血病；熊果酸；凋亡；Bcl-2 [中图分类号] R733.710；R735.205 [文献标识码] A [文章编号] 2095-0616（2013）17-30-03 熊果酸（ursolic acid，UA）又名乌索酸、乌苏酸，广泛分布于白花蛇舌草、女贞子、乌梅、夏枯草等天然植物中。长久以来，熊果酸作为待开发的抗炎和降血脂的药物，在临床前动物实验中表现突出。近年来，熊果酸的抗肿瘤活性成为最受关注的研究方向。据研究报道，熊果酸可引起多种肿瘤细胞如肺癌、乳腺癌、肝癌、前列腺癌等发生凋亡。熊果酸也可以诱导人白血病细胞发生凋亡[1]，但其诱导白血病细胞凋亡的作用机制还不十分清楚。Bcl-2（B cell lymphoma/leukemia-2）是最重要的抑制肿瘤细胞凋亡基因，bax是第一个被确定的Bcl-2同源基因，可拮抗Bcl-2的保护效应而使细胞趋于凋亡。 本研究体外观察了熊果酸诱导人急性髓性白血病细胞系（HL-60）细胞增殖和诱导凋亡作用，并观察Bcl-2和bax基因表达的影响，进一步阐述细胞凋亡的分子机制。 1 材料与方法 1.1 药品与试剂 UA（Sigma 公司），小牛血清（杭州四季青生物有限公司）；PVDF膜（Pall公司）；DMSO和MTT（均为Ameresco 公司）；1640培养基（GiBco公司）；鼠抗人Bcl-2单抗、鼠抗人bax单抗、兔抗人Bcl-2多抗、兔抗人bax多抗（Santa Cruz公司）；兔抗人β-actin（Sigmma公司）。 1.2 细胞培养 人急性髓性白血病细胞系HL-60细胞（武汉大学中国典型培养物保藏中心提供）。用含10%小牛血清的RPMI-1640培养基于37℃，5% CO2的培养箱内常规培养，取对数生长期细胞用于实验。 1.3 UA对HL-60细胞生长的影响 细胞接种于96孔培养板，加入20μL不同浓度UA、阳性药物ATRA，使其终浓度分别为0.1、0.3、1.0、3.0和10.0μmol/L，每组设4个复孔，处理48h。加入MTT液20μL，继续培养4h后，离心5min，弃上清，加入DMSO 100μL，震荡溶解；在570nm波长测吸光度（A）值。计算相对增殖抑制率（IR），IR（%）=（1-实验组A均值/对照组A均值）×100%。以上实验重复3次。 1.4 细胞凋亡和细胞周期分布 用含0.1%小牛血清的培养基处理24h进行细胞周期同步化后，分别加入不同浓度的UA和ATRA，处理48h收集细胞，用PBS吹打细胞成单细胞悬液，离心，冷PBS洗2遍，乙醇固定24h后，经碘化丙啶（PI）染色，流式细胞仪检测细胞凋亡。分别加入浓度为0.0、0.1、1.0、10.0μmol/L的UA同样处理48h流式细胞仪检测细胞周期分布。 1.5 Western blot法检测Bcl-2/bax蛋白水平 UA 0.1、1.0和10.0μmol/L处理HL-60细胞24h后裂解细胞分离提取蛋白并定量，每泳道加入25μg蛋白样品，10% SDS电泳后转移至PVDF膜上，5%脱脂牛奶封闭2h，按照抗体说明要求分别加入适当浓度的抗Bcl-2、抗bax、抗β-actin的抗体孵育2h；TBS洗膜3次后以ECL发光试剂盒显色，NIH软件分析蛋白条带灰度。 1.6 统计学分析 各组实验数据均用（）表示，采用SPSS13.0软件One Way ANOVA方式行方差分析，两两比较采用Student’s t 检验。 2 结果 2.1 MTT法检测UA对HL-60细胞增殖活性的影响 UA明显抑制HL-60细胞生长，和ATRA作用效价相近。见表1。 2.2 流式细胞术检测UA诱导HL-60细胞凋亡和对细胞周期分布的影响 UA以浓度依赖方式诱导HL-60细胞凋亡，并表现为细胞周期G1期阻滞。见表2～3。 2.3 UA对HL-60细胞Bc