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雌二醇对内毒素诱导骨髓巨噬细胞白介素―10表达影响和机制探究 　　[摘要] 目的 研究雌二醇对内毒素诱导的小鼠骨髓巨噬细胞白介素-10（IL-10）的表达调控作用及其相关机制，以期为临床更好地防治相关炎性疾病提供新思路。方法 选用4周龄C57BL/6j雄性小鼠，体外培养骨髓巨噬细胞。收集细胞，用激光共聚焦扫描显微镜检测雌激素受体。将细胞与内毒素孵育的同时，分别加入雌二醇，他莫昔芬及雌二醇，24h后收集培养液，用ELISA法检测IL-10的含量，并提取细胞蛋白，用Western blotting法检测各处理组核转录因子κB（NF-κB）的激活情况。 结果 激光共聚焦扫描显微镜检测结果显示小鼠骨髓巨噬细胞表达雌激素受体。ELISA检测结果显示内毒素诱导细胞表达IL-10，雌二醇本身对IL-10的表达无影响，却可抑制内毒素诱导的IL-10表达，而此抑制作用被他莫昔芬拮抗。同时，Western blotting检测到内毒素激活细胞NF-κB通路，雌二醇抑制内毒素诱导的NF-κB活化，而此抑制作用可被他莫昔芬拮抗。结论 雌二醇通过雌激素受体抑制内毒素诱导的小鼠骨髓巨噬细胞IL-10的表达，此抑制作用与雌激素抑制内毒素对细胞NF-κB通路的激活有关。 [关键词] 雌激素；巨噬细胞；白介素-10；核转录因子-κB [中图分类号] R363 [文献标识码] A [文章编号] 2095-0616（2013）19-24-03 雌激素是机体重要的激素之一，不仅在雌性个体的发生、生长发育和生殖等方面起着至关重要的作用，还具有多种生物效应，大量临床及流行病学资料显示，雌激素可调控炎症反应，其作用机制复杂多样，影响某些涉及炎性病理过程的疾病的发生发展及转归[1]。目前，性激素影响机体炎症反应的研究热点集中在性激素对炎性细胞的调节上[2]。本 实验在体外分离培养小鼠骨髓巨噬细胞，用内毒素激活巨噬细胞表达，研究雌二醇对巨噬细胞抗炎介质白介素-10（interleukin-10，IL-10）的表达调控作用及相关机制，以期为临床更好地防治相关炎性疾病提供新思路。 1 材料与方法 1.1 材料 4周龄雄性C57BL/6j小鼠，购自中国科学院上海实验动物中心。RPMI 1640培养基购自美国Gibco公司；胎牛血清购自杭州四季青公司；小鼠巨噬细胞集落刺激因子，IL-10 ELISA试剂盒购自美国RD公司；雌激素受体α抗体，雌激素受体β抗体，NF-κB （65kDa）抗体， 聚合酶PARP抗体，辣根过氧化物酶-二抗，异硫氰酸荧光素-二抗购自美国Santa Cruz公司。内毒素，雌二醇，他莫昔芬购自美国Sigma公司。 1.2 方法 1.2.1 BMM的制备 选用4周龄雄性C57BL/6j小鼠[实验动物使用许可证号：SYXK（苏）2007-0035]，颈椎脱臼处死。无菌条件下取双侧股骨，剪去骨两端，用RPMI 1640培养液冲洗骨髓腔，收集骨髓细胞，分散后培养于含巨噬细胞集落刺激因子（10ng/mL）及10%胎牛血清的RPMI 1640培养液中。1d后，去除贴壁细胞，收集未贴壁细胞，调整细胞浓度至5×106个/mL，置于含巨噬细胞集落刺激因子（10ng/mL）的RPMI 1640完全培养液中继续培养，5d后收集贴壁细胞备用。 1.2.2 激光共聚焦扫描显微镜检测雌激素受体的表达 取200?L细胞悬液，滴加于多聚赖氨酸包被的盖玻片上，0.5%多聚甲醛固定30min，避光分别于与雌激素受体α、β抗体孵育30min，磷酸盐缓冲液漂洗玻片，异硫氰酸荧光素-二抗孵育30min，磷酸盐缓冲液漂洗玻片，孵育完毕，用激光共聚焦扫描显微镜检测荧光分布状况。 1.2.3 ELISA检测细胞因子白介素-10的表达 实验按不同处理因素分为空白对照组、内毒素组（1μg/mL）、雌二醇组（1nM）、雌二醇+内毒素组、他莫昔芬（10nM）+雌二醇+内毒素组，24h后吸取培养上清用于细胞因子IL-10的测定。采用ELISA抗体夹心法，每组设3个复孔，具体操作步骤参照试剂盒说明书。 1.2.4 Western blotting分析NF-κB的活化 实验分组同上，处理因素作用24h后，提取细胞核蛋白用Western blotting法检测NF-κB的活化。按每孔50μg 蛋白进行SDS电泳，然后将蛋白转移至PVDF膜上（Millipore， MA，USA），将膜用含5%脱脂奶粉的TBST缓冲液（10mM Tris，150mM NaCl，and 0.05% Tween 20）在室温下封闭1h后，与特异性一抗（用TBST缓冲液按1?2000稀释）室温下孵育2h，再与辣根过氧化物酶-二抗室温孵育1h，然后将膜经化学发光法检测，暗室曝光，胶片