青蒿琥酯对胃癌细胞系HGC27细胞增殖、凋亡影响和其机制.docVIP

青蒿琥酯对胃癌细胞系HGC27细胞增殖、凋亡影响和其机制 　　[摘要] 目的 探讨青蒿琥酯对大胃癌细胞系HGC27细胞增殖、凋亡的影响及其机制。 方法 体外培养HGC27细胞，采用不同浓度青蒿琥酯处理24、48、72 h，MTT法测定其对HGC27细胞增殖的影响；倒置显微镜下观察细胞的形态学变化；青蒿琥酯（浓度分别为20、40、80 mg/L）处理HGC27细胞48 h后，分别采用流式细胞仪检测细胞凋亡、分光光度计检测Casepase-3、Caspase-9相对活性、Western blot法检RUNX-3蛋白表达情况。 结果 青蒿琥酯（浓度10～100 mg/L）能抑制HGC27细胞的增殖，呈剂量和时间依赖性；倒置显微镜下可观察到典型的细胞凋亡形态。青蒿琥酯（浓度分别为20、40、80 mg/L）作用HGC27细胞48 h后，细胞凋亡率分别为11.5%、21.4%、36.6%，而对照组凋亡率仅为2.2%；处理后Casepase-3相对活性分别为（0.19±0.02）、（0.25±0.04）和（0.31±0.03），对照组为（0.11±0.02），Casepase-9相对活性分别为（0.18±0.02）、（0.23±0.03）和（0.30±0.04），对照组为（0.10±0.02），与对照组比较，青蒿琥酯处理组Casepase-3、Caspase-9相对活性显著增加，差异均有统计学意义（均P 　　[Key words] Artesunate； HGC27 cell； Caspase-3； Caspase-9； RUNX-3 胃癌是常见的消化道恶性肿瘤，胃癌死亡率居肿瘤相关死亡率前列[1]。我国胃癌的发病率呈逐年上升趋势，严重威胁着人民群众的生命健康。胃癌治疗方法以手术切除为主，辅以化疗，但常规的化疗药物毒性大且常出现耐药性，因此寻找有效且毒副作用小的抗肿瘤药已经成为国内外研究热点。青蒿素及其衍生物是我国自主知识产权的高效速效抗疟药物。近年来研究发现，青蒿素及其衍生物除了有抗疟作用外，还对人类多种肿瘤细胞具有明显的杀伤或抑制作用[2-4]，但具体机制尚不十分清楚。为探讨青蒿素衍生物之一青蒿琥酯的抗癌机制，本研究以人胃癌HGC27细胞为对象，观察青蒿琥酯对人胃癌细胞增殖、凋亡的影响，并检测青蒿琥酯对人胃癌细胞Caspase-3、Caspase-9活性变化及抑癌基因人类相关转录因子3（human runt-related transcription factor 3，RUNX3）表达的影响。 1 材料与方法 1.1 材料 人胃癌细胞HGC27细胞购自中国科学院上海细胞库；青蒿琥酯购于桂林南药股份有限公司；AnnexinV/PI试剂盒购于BENDER公司；胎牛血清购自Invitrogen公司；RPMI1640培养液购于杭州四季青生物材料研究所；胎牛血清系GIBCO产品；MTT试剂盒购于武汉谷歌生物科技有限公司；Caspase-3、Caspase-9活性检测试剂盒购于南京凯基生物科技发展有限公司；RUNX-3单克隆抗体购自Cell Signaling Technology公司；辣根酶标记兔抗山羊IgG购自武汉博士德生物科技有限公司。 1.2 方法 1.2.1 细胞培养 HGC27细胞培养于RPMI1640培养液中（含10%小牛血清，100 U/mL青霉素，100 μg/mL链霉素），置于37℃，饱和湿度，5%CO2培养箱内培养，根据生长情况3～5 d传代一次。 1.2.2 MTT法检测细胞增殖抑制率 取对数生长期的HGC27细胞，制成细胞悬液，以1×104/mL的浓度接种于96孔板，每孔200 μL，待细胞贴壁后分组：青蒿琥酯组加入青蒿琥酯终浓度为10、20、40、80、100 mg/L的培养液，对照组加入等量的培养液，并设立调零孔。每组设5个复孔，分别培养24、48、72 h，实验结束前4 h加入MTT试剂20 μL/每孔，继续孵育4 h，小心吸掉上清，每孔加150 μL DMSO，振荡10 min，使结晶充分溶解，酶标仪上检测每孔在570 nm处的吸光值（A值）。抑制率=[1-（实验组平均A值-调零孔A值）/（对照组平均A值-调零孔A值）]×100%。 1.2.3 显微镜下观察细胞形态 取对数生长期细胞消化传代并培养24 h后，换青蒿琥酯终浓度为10、20、40、80、100 mg/L的培养液连续培养24、48、72 h后置于倒置显微镜下观察细胞生长情况。 1.2.4 流式细胞仪检测细胞凋亡 取对数生长期细胞，以1×106/mL浓度接种于6孔培养板中，贴壁后分为实验组和对照组，实验组分别加入青蒿琥酯终浓度为20、40、80 mg/L的培养液，对照组加入等量培养液，培养48