关于简要介绍《荧光定量PCR法检测邻苯二甲酸酯的研究》报告.ppt

简要介绍《荧光定量PCR法检测邻苯二甲酸酯的研究》报告 contents 1 2 3 技术背景 技术原理 具体实施方式 技术背景 此项技术用分子生物学技术工具来解决环境污染物检测 任务 ① 邻苯二甲酸酯为类雌性激素，是塑料增塑剂，普遍存在于土壤、水、生物、大气降尘等环境中，是全球性环境有机污染物； ②现今检测方法有：GC,LC,GC-MS,LC-MS,荧光法等； ③ 以上方法有成本高，操作复杂，分析时间长等缺点； 此项技术方法的优点：准确度高、抗干扰强 、高通量； contents 1 2 3 技术背景 技术原理 具体实施方式 技术原理 这种结合受体迁移到细胞核与并核内DNA上雌激素反应位点结合 翻译产物蛋白质进入相应的靶组织或靶器官，从而引起雌激素效应 使其调节雌激素响应基因的转录和翻译 邻苯二甲酸酯与细胞膜或细胞质中的雌激素受体结合 邻苯二甲酸酯作为雌激素受体的配体，能与雌激素受体结合并能诱导雌激素受体介导的基因表达； 技术原理 1. 2. 3. 邻苯二甲酸酯诱导雌激素受体与特异性的双链DNA结合 体系中游离的DNA被S1核酸酶完全降解，不能被扩增 被酶切后结合有受体的特异性DNA作为模板，再结合SYBR Green 1荧光定量PCR技术对DNA含量进行检测,从而估算PAEs含量 contents 1 2 3 技术背景 技术原理和流程 具体实施方式 具体实施方式 邻苯二甲酸二甲酯，PCR试剂盒，SYBR Green I PCR mix,核酸外切酶EXOIII,S1核酸酶，PUC19,其他试剂； 试剂 UV-2000紫外分光光度计，Rotor-gene 3000荧光定量PCR仪，DYY-11型电泳仪，Tanon-2500R数码胶图像处理系统； 仪器 引物设计 上游引物R1:5’CAGGTCAGACTCACCTGCTTCCTCGCTCACTG 3’ 下游引物 R2：5GTCCAGTCTCACYGGACAGGCAACTATGGATG 3’ 具体实施方式-技术方法流程图 养鱼 暴露 提取肝中受体 受体-配体复合物 纯化受体-配体复合物 PUC19 合成结合DNA 引物 受体-配体-结合DNA复合物 混合液 加入EXOIII核酸酶 加入S1核酸酶 加入S1停止液，灭活 PCR模板 荧光定量PCR 常规PCR 具体实施方式-结果与分析-结合DNA地凝胶电泳分析 回收结合DNA地凝胶电泳图谱 常规PCR扩增后产物于质量分数1%琼脂糖凝胶电泳分析。 ② 用PCR产物快速纯化试剂盒回收后，用紫外分光光度法测OD260/280为1.86。表明回收DNA纯度高； 结合DNA地凝胶电泳分析 具体实施方式-结果与分析-荧光定量PCR ☆ 邻苯二甲酸酯配体质量浓度C（g/L）对数与Ct值具有线性关系； ☆ Ct=-0.273*Log(C)+6.320,R2=0.9948； ☆ 检出限为10^（-10）g/L 1 不同浓度邻苯二甲酸酯诱导结合DNA地SYBR Green I 荧光定量PCR 具体实施方式-结果与分析-加标回收分析 回收率81.6%-97.6% 1 2 3 相对标准偏差2.69%-4.45% 建立外切酶保护-荧光定量PCR方法准确度高 加标回收分析 具体实施方式-结果与分析-河水样品预处理测定结果 其检测范围为10-100ug/ml 松江东华大学张家浜河水样品预处理测定结果 文献观后-推测与展望 1.酶切对温度要求比较高，且成本也高；可寻求高效、稳定、价廉的酶； 2.该方法的重复性有待进一步考证及改进； 3.SYBR Green I荧光定量PCR并不是目前最高的特异性方法，可采用特异性更强的技术改定定量PCR； Thank you 具体实施方式-技术操作步骤-①含有受体细胞溶质的提取 1、取体长为12cm左右的鲤鱼（20尾），用含有0.05mg/L的邻苯二甲酸酯的水喂养两周后取出肝脏； 2、用冰上预冷的0.15mol/L氯化钾溶液去除肝脏外围血液后，吸干其表面水分； 3、按照m(肝脏mg)：v（缓冲液，mL）=1:4的比例加入HEDG缓冲液（冰上预冷）后匀浆； 4、匀浆液与12000r/min离心1h，收集上清； 5、把收集好的上清液，即为含有雌激素受体的细胞溶质，分装后于-80℃保存备用； 具体实施方式-技术操作步骤-②结合DNA的制备 50 ul 扩增体系 1 灭活双蒸水 36ul 2 0.2ug/ul pUC19质粒模板工作液 2ul 3 10倍PCR缓冲液 5ul 4 10mmol/L dNTPs 1ul 5 10umol/L上游引物R1 2ul 6 10umol/L下游引物R2 2ul 7 2U/ul Taq 酶 2ul 具体实施方式-技术操作步骤-②结合DNA的制备 常规PCR循环步骤 1 预变性94℃ 5min