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分子克隆实验原理 分子克隆实验原理 一、菌种保存和活化 二、质粒提取和保存 三、感受态细胞的制备 四、载体的制备 五、基因的制备 六、连接 七、转化 八、重组克隆的筛选 菌种保存和活化 一.甘油菌保存： 1、 100 ul菌液＋100 ul灭菌甘油 【混匀】 2、多制备几管，做上标记【菌名，质粒，时间】 3、－20 ℃可保存半年；【－80 ℃可长期保存】 二、甘油菌活化： 1、取一管甘油菌，混匀； 2、用接种针接种并在培养平板上划线； 3、37 ℃倒置培养12 h； 4、挑单克隆于2.5ml LB (视情况加抗生素），37 ℃振荡培养12 h. 【注明：甘油菌用完后，最好扔掉，反复冻融易死亡。】 质粒的提取原理－碱裂解法 三种溶液： 溶液1： 50 m mol/l 葡萄糖维持渗透压，防止DNA受机械损伤降解； 25 m mol/l Tri· Cl （pH 8.0)维持 pH; 10 m mol/l EDTA (pH 8.0)螯合Ca2+, DNase 失活，保护DNA 溶液2： 0.2 mol/ NaOH核酸变性（pH12或pH3) (解链） 1% SDS蛋白变性，裂解细胞。 溶液3： 7.5 mol/L NH4AC （pH 7.6) 沉淀蛋白，大分子核酸，调节pH,使小分子核酸复性（可溶）。 其它溶液： （1）2M NH4AC沉淀蛋白，溶解核酸； (2) 异丙醇沉淀质粒 （3）70％乙醇沉淀质粒，除去异丙醇，盐分。 (4) RNase除去细菌RNA 质粒的提取原理－碱裂解法 Protocal: 1.5 ml 菌液， 12000 rpm * 1 min, 弃上清 （repeat) －－收集细菌 溶液1 (200 ul), 剧烈混匀－－－－－－－－－－－－－提供缓冲液 溶液2 (400 ul)，温柔混匀，冰中5 min;－－－－－－－裂解细胞，蛋白核酸变性 溶液3 (300 ul), 温柔混匀，冰中10 min;－－－－－－－质粒复性 13000 rpm* 5 min, 取上清；－－－－－－－－－－－－除去细菌蛋白，基因DNA 540 ul 异丙醇， 室温 10 min;－－－－－－－－－－－－沉淀质粒 14000 rpm * 10 min, 弃上清；－－－－－－－－－－－－除去可溶性杂质 100 ul 2M NH4AC 13000 rpm* 5 min, 取上清； 100 ul 异丙醇，室温10 min; 14000 rpm * 10 min, 弃上清； 70%乙醇500 ul, 14000 rpm * 10 min, 弃上清；－－－－－除去异丙醇，盐分 烘干10-30 min, －－－－－－－－－－－－－－－－－ 除去乙醇 50 ul ddH2O (含0.1 mg/ ml RNase), 37°C* 30 min.－－－－除去细菌RNA 电泳鉴定 质粒的保存 1.ddH2O (可含EDTA) 中可短期保存 [4 ℃保存1月; -20 ℃可保存一年] 2. 75%乙醇可长期保存. 3. 烘干可长期保存(可能难溶) 感受态细胞的制备 1. 菌种活化 2.取0.5ml菌液至50ml LB培养液中； 3、37 ℃ ，振荡培养2h至对数期； 4、转至50 ml无菌塑料管， 0 ℃ *10 min; 5、5000 rpm *10 min * 4 ℃ 6、取沉淀，加25ml 50mM CaCl2【0 ℃，无菌】 7、 5000 rpm *10 min * 4 ℃ 8、取沉淀, 加 2 ml 含15％甘油的50 mM CaCl2重悬，200 ul/tube分装，液氮速冻后至－80 ℃冰箱保存（半年有效）。 【注意：（1）需要做一个无质粒的对照 （2）并用已知质粒转化，鉴定感受态细胞的转化效率－－大约106【1ug PUC 质粒，产生克隆106 】 载体的制备 1、酶切（放大体积100 ul，要充分) 2、胶回收（注意远紫外照射时间不能太长，防止DNA突变） 3、纯度，浓度测定。(电泳测定） 基因的制备(*) 1、PCR扩增 2. 酶切 3、胶回收 4、纯度，浓度测定 连接 转化 1、连接产物 5 ul加入感受态细胞中； 2、混匀，冰上30mincell 吸附DNA 3、42 ℃, 90 s－－－－热击，促进DNA进入cell 4、冰上1～2min－－使细胞复原 5、加1ml LB (无 Amp)－－外源DNA还未表达 6、 37 ℃培